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【摘要】反相高效液相色譜法；黃芩苷；血藥濃度

【關(guān)鍵詞】反相高效液相色譜法；黃芩苷；血藥濃度

Abstract:ObjectiveArapidsensitiveRPhplcmethodwasdevelopedtodeterminebaicalinintherabbits’plasma.MethodsTherabbits''''plasmawaspretreatedbyprecipitatingwithacetonitrile.DiamonsolTMC18columnwasused.Themobilephasewasconsistedofmethanol,waterandphosphate（55∶45∶0.2).Theflowratewas1.0mL/min,andtheUVdetectionwassetat277nm.Benzoicacidwasusedasinternalstandard.ResultsThelinearcalibrationcurveswereobtainedintheconcentrationrangeof1~50μg/mL(r=09993).ThewithindayandbetweendayRSDwerewithin2.8%and4.0%respectively,relativerecoveryrateandextractionrecoveryratewere95.5%and62.3%respectively.ConclusionsThemethodissimple,rapidandsuitableforthedeterminationofconcentrationofplasmaandthestudyofpharmacokinetics.

Keywords:baicalin;RPHPLC;concentrationofplasma

黃芩苷是從唇形科植物黃芩（ScutellariabaicalensisGeorgi）的干燥根提取所得的黃酮類物質(zhì)，具有抗炎抗變態(tài)反應(yīng)、抗微生物、解熱、降壓利尿、降血脂血糖、利膽解痙等作用［1～2］。黃芩苷是多種中藥制劑的有效成分，因此建立黃芩苷的血藥濃度測定方法，具有重要意義。本文在文獻［34］基礎(chǔ)上，進行測定條件優(yōu)化，采用RPHPLC法，以苯甲酸為內(nèi)標物測定家兔血漿中黃芩苷的含量，此方法具有簡便、專屬性強、準確及應(yīng)用性強等優(yōu)點，為研究其體內(nèi)代謝提供方法依據(jù)。

1儀器與藥品

LC10A型高效液相色譜儀（日本島津公司）；SPD10AVP紫外可見分光光度檢測器（日本島津公司）；HW2000色譜工作站。漩渦混合器(天津藥典標準儀器廠)；高速臺式離心機（上海安亭科學儀器廠）；超聲波清洗器（天津恒奧超聲波清洗器）。黃芩苷對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號:110715-200514），黃芩苷原料藥（廣州市億深天然產(chǎn)物科技發(fā)展有限公司），內(nèi)標物苯甲酸為分析純（天津市大茂化學試劑廠），甲醇、乙腈為色譜純（天津市四友生物醫(yī)學技術(shù)有限公司），試驗用兔子（購于廣東省衛(wèi)生廳實驗動物中心）。

2方法與結(jié)果

2.1色譜條件以文獻［3］中色譜條件為基礎(chǔ)改進，色譜柱為DiamonsolTMC18柱（250mm×4.6mm,ID,5μm）；流動相：甲醇水磷酸（體積比55∶45∶0.2）；流速：1mL/min；檢測波長：277nm；柱溫：室溫；進樣量：10μL。

2.2溶液的制備

2.2.1對照品溶液的制備精密稱取黃芩苷對照品25mg，置50mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，即得0.5mg/mL的黃芩苷對照品儲備液。分別精密吸取黃芩苷對照品儲備液0.1、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL分別置10mL容量瓶中，用重蒸水定容，配成5、25、50、100、150、200、250μg/mL的系列黃芩苷對照品標準溶液。

2.2.2血漿樣品處理取含有一定量黃芩苷的血漿0.4mL至5mL離心管中，加入重蒸水0.4mL，內(nèi)標物溶液（0.45mg/L苯甲酸甲醇溶液）0.4mL，乙腈0.8mL，漩渦混合30s，超聲振蕩5min，于3000r/min的高速離心機上離心10min，取上清液經(jīng)0.45μm微孔有機濾膜濾過，取續(xù)濾液10μL進樣，記錄色譜圖。

A.空白血漿；B.空白血漿+20μg/L黃芩苷+90μg/L苯甲酸甲醇溶液；C.血漿樣品

a.黃芩苷;b.苯甲酸

圖1樣品測定色譜圖（略）

Fig.1Chromatogramsofratplasmasamples

2.3方法的專屬性取空白血漿0.4mL，除不加內(nèi)標物溶液外，按“2.2.2”項下操作，得色譜圖1A，將一定濃度的黃芩苷標準液和內(nèi)標物溶液加入空白血漿中，依法操作，得色譜圖1B，待測物黃芩苷與內(nèi)標苯甲酸的保留時間分別為9.8min和11.7min；取血漿樣品，依同法操作，得色譜圖1C。結(jié)果表明，空白血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)不干擾待測物黃芩苷及內(nèi)標物的測定。

2.4標準曲線和線性范圍取空白血漿0.4mL，加入黃芩苷標準系列溶液0.4mL，配制成相當于黃芩苷血漿質(zhì)量濃度為1.0、5.0、10.0、20.0、30.0、40.0、50.0μg/mL，除不加入重蒸水0.4mL外，按照“2.2.2”項下依法操作。進樣10μL，記錄色譜圖；以待測物質(zhì)量濃度為橫坐標，待測物與內(nèi)標物的峰面積比值為縱坐標，用最小二乘法進行回歸運算，求得直線回歸方程：Y=0085179x-0.00244，r=0.9993，表明黃芩苷質(zhì)量濃度在1~50μg/mL內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，定量下限為0.11μg/mL。

2.5精密度與準確度取空白血漿0.4mL按照“2.4”項下方法制備黃芩苷低、中、高3個濃度（5.0，50.0，250.0μg/mL）的樣品，每一濃度進行3樣本分析，連續(xù)測定3d，并與標準曲線同時進行。以當天的標準曲線計算樣品的濃度，求得方法的精密度與回收率，結(jié)果見表1。

表1黃芩苷的準確度和精密度試驗結(jié)果（略）

Tab.1AccuracyandprecisionoftheHPLCdeterminationofbaicalin

2.6提取回收率考察取空白血漿0.4mL，按“2.4”項下的方法制備低、中、高3個濃度（5.00，50.0和250.0μg/mL）的樣品，每個濃度測定3個樣品。同時另取空白血漿0.4mL，除不加重蒸水外，按“2.2.2”項下處理，分取上清液，加入相應(yīng)濃度的標準溶液0.4mL，混勻，進樣分析，獲得相應(yīng)的峰面積。以每一濃度2種處理方法的峰面積比值計算提取回收率。結(jié)果表明，黃芩苷血漿濃度在5.00，50.0和250.0μg/mL時的提取回收率分別為61.2％，635％，62.3％，內(nèi)標溶液經(jīng)同法提取處理，其提取回收率為64.8％。

2.7血漿樣品的測定取含有一定量黃芩苷的血漿0.4mL，按照“22.2”項下進行操作，進行6個樣本分析，測得血藥濃度為17.96μg/mL，RSD為2.1%。

3討論

3.1內(nèi)標物的選擇根據(jù)文獻［3-6］報道，選對硝基苯甲酸作內(nèi)標物，測定結(jié)果與供試品峰重疊；另分別選水楊酸、苯甲酸作內(nèi)標物，實驗結(jié)果顯示苯甲酸與供試品的分離度在1.5～20，符合要求，且在室溫（15～30℃）柱效及分離度不受干擾。

3.2蛋白沉淀劑的選擇分別選用四氫呋喃、乙腈、甲醇作為蛋白沉淀劑及提取溶液，經(jīng)提取回收率的比較，甲醇的提取率較低，而乙腈和四氫呋喃的效果相當；由于四氫呋喃對色譜測定有干擾，最后選擇乙腈作為蛋白沉淀劑及提取液。

3.3本實驗的方法準確，簡單、靈敏，能滿足生物樣品分析的要求，為黃芩苷的血藥濃度測定提供依據(jù)。

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