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【摘要】測(cè)定蛇毒纖溶酶的半數(shù)致死量（LD50）并研究蛇毒纖溶酶的急性毒性。方法小鼠單次靜脈注射蛇毒纖溶酶，觀察14天內(nèi)的毒性反應(yīng)和死亡情況并計(jì)算出LD50。結(jié)果蛇毒纖溶酶的LD50為24783u/kg，95%可信限為21519～28823u/kg，中毒死亡時(shí)間集中在給藥后48h，其毒性靶器官主要是胃、十二指腸、空腸、肺、胰。結(jié)論蛇毒纖維蛋白溶解酶具有纖溶藥相同的毒性癥狀，有出血傾向。

【關(guān)鍵詞】蛇毒纖溶酶急性毒性半數(shù)致死量

【Abstract】ObjectiveTomeasurethemedianlethaldose（LD50）ofnevinfibrinolyticenzymeandinvestigateitsacutetoxicityinmice.MethodsAftersingleintravenousdosing,thetoxicityreactionsandthenumberofdeathsofnevinfibrinolyticenzymewereobservedfor14daysinmice,thentheLD50wascalculated.ResultsTheLD50ofnevinfibrinolyticenzymewas24783u/kg,andits95%confidentintervalwas21519～28823u/kg.Thetargetorganswerestomach,duodenum,jejunum,lungandpancreas.Thedeathfocuson48haftertheadministration.ConclusionNevinfibrinolyticenzymehasthesametoxicityastheotherfibrinolyticenzymes,whichhasbleedingtendency．

【Keywords】nevinfibrinolyticenzyme;acutetoxicity;LD50

蛇毒中含多種具有生物活性的酶、多肽和蛋白質(zhì),其特殊的功能已在科學(xué)研究和醫(yī)療實(shí)踐中獲得了廣泛應(yīng)用。利用蛋白質(zhì)分離技術(shù)從蛇毒中高度純化而得的蛇毒纖溶酶可直接溶解纖維蛋白凝塊，可用于心腦血栓和心肌梗死的治療。近年來(lái)未見(jiàn)對(duì)蛇毒纖溶酶毒性的研究報(bào)道，為此本文對(duì)蛇毒纖溶酶急性毒性進(jìn)行了初步研究。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1動(dòng)物NIH小鼠，SPF級(jí)，50只，雌雄各半，購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心［實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：0026628，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（粵）2003-0002，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物監(jiān)測(cè)證號(hào)：粵監(jiān)證字2007A004］。

1.1.2試劑和藥物蛇毒纖溶酶（批號(hào)：070274，北京博康寧生物醫(yī)藥科技有限公司）；0.9％氯化鈉注射液（批號(hào)：060626-07，昆明市宇斯藥業(yè)有限責(zé)任公司）；甲醛溶液（批號(hào)：20061101-11，廣州化學(xué)試劑廠）。

1.1.3儀器全密封自動(dòng)脫水機(jī)（ASP300，德國(guó)Leica公司）；平推式切片機(jī)（MicromMH400，德國(guó)Leica公司）；生物組織包埋機(jī)（LeicaEG1164，德國(guó)Leica公司）；病理圖像分析系統(tǒng)（廣州億鳴公司）。

1.2方法［1,2］選用檢疫合格的NIH小鼠50只，將動(dòng)物按體重、性別隨機(jī)分為5組，每組10只動(dòng)物（雌雄各半），根據(jù)預(yù)試結(jié)果給藥劑量設(shè)定為38000、30400、24320、19456、15565u/kg，給藥容積為0.2ml/10g。給藥后連續(xù)觀察4h，如無(wú)異常則終止持續(xù)觀察，改為每天觀察1次，觀察至給藥后第14天，觀察內(nèi)容包括：動(dòng)物外觀體征、行為活動(dòng)、腺體分泌、呼吸、糞便、給藥局部、動(dòng)物死亡數(shù)量、死亡時(shí)間、瀕死前反應(yīng)等。每組動(dòng)物分別于給藥前及給藥后1、2、3、7、14天稱體重6次。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中因?yàn)l死而處死的動(dòng)物、死亡的動(dòng)物以及實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)仍存活的動(dòng)物均進(jìn)行大體解剖，肉眼觀察主要臟器變化，若有異常均應(yīng)記錄并進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。飼養(yǎng)室溫度與濕度：20～26℃，40%～70%。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間均數(shù)比較用t檢驗(yàn)，按Bliss法計(jì)算LD50及95%可信限。

2結(jié)果

2.1給藥后毒性反應(yīng)癥狀及LD50值38000u/kg劑量組動(dòng)物給藥后即刻出現(xiàn)少動(dòng)、呼吸急促的現(xiàn)象，然后趴臥不動(dòng)，約30min后有6只小鼠死亡，1只小鼠在給藥后約1h死亡，3只小鼠在給藥后約3h死亡，該劑量組動(dòng)物死亡前主要反應(yīng)為陣攣性抽搐、全身震顫、角弓反張、翻正反射消失，其中有2只動(dòng)物鼻腔出血。30400u/kg劑量組動(dòng)物給藥后即刻亦出現(xiàn)少動(dòng)、呼吸急促的現(xiàn)象，有4只動(dòng)物在給藥6h內(nèi)死亡，動(dòng)物死亡前主要反應(yīng)為陣攣性抽搐、全身震顫以及腹式呼吸。本組2只動(dòng)物在給藥后第2日死亡。24320、19456、15565u/kg劑量組動(dòng)物給藥后即刻出現(xiàn)少動(dòng)、呼吸急促的現(xiàn)象，大部分動(dòng)物約10min后恢復(fù)正常，動(dòng)物死亡發(fā)生在藥后48h內(nèi)。從藥后第3天到藥后第14天，幸存動(dòng)物活動(dòng)狀況良好，無(wú)異常表現(xiàn)。各組動(dòng)物死亡時(shí)間分布情況見(jiàn)表1。用Bliss法計(jì)算蛇毒纖維蛋白溶解酶單次靜脈注射給藥NIH小鼠的LD50為24783u/kg，95%可信限為21519～28823u/kg，見(jiàn)表2。表1NIH小鼠單次靜脈注射蛇毒纖維蛋白溶解酶后死亡情況分布表表2NIH小鼠單次靜脈注射蛇毒纖維蛋白溶解酶的LD50測(cè)定（Bliss法）

2.2體重變化靜脈注射給藥后第1天除15565u/kg劑量組動(dòng)物體重維持在給藥前水平外，其余各劑量組動(dòng)物均出現(xiàn)體重下降現(xiàn)象。從給藥后第2天開(kāi)始，各劑量組幸存動(dòng)物體重逐漸增長(zhǎng)，且體重增加幅度相近，見(jiàn)表3。表3NIH小鼠單次靜脈注射蛇毒纖維蛋白溶解酶后體重變化情況

2.3病理組織學(xué)檢查結(jié)果蛇毒纖維蛋白溶解酶各劑量組給藥后死亡和瀕死的動(dòng)物剖檢發(fā)現(xiàn)胃近幽門(mén)部、腸系膜、十二指腸、空腸、肺、胰均有出血和充血的現(xiàn)象，對(duì)這些異常的組織臟器進(jìn)行組織病理學(xué)檢查可見(jiàn)：肺臟間質(zhì)均出現(xiàn)彌漫性大量紅細(xì)胞，支氣管周?chē)g質(zhì)更為嚴(yán)重，有的還可見(jiàn)溶解的紅細(xì)胞，為急性肺出血。胰腺出現(xiàn)不同程度的出血，胰腺小葉間質(zhì)較寬，并可見(jiàn)有數(shù)量不等的紅細(xì)胞，有的還可見(jiàn)溶解的紅細(xì)胞。胃出現(xiàn)不同程度出血，胃黏膜層、黏膜下層可見(jiàn)數(shù)量不等的紅細(xì)胞。十二指腸出現(xiàn)不同程度出血，十二指腸黏膜固有層、黏膜下層可見(jiàn)數(shù)量不等紅細(xì)胞，部分動(dòng)物十二指腸黏膜固有層出現(xiàn)輕度水腫?；啬c出現(xiàn)輕度出血，回腸黏膜固有層、黏膜下層可見(jiàn)少量紅細(xì)胞，部分動(dòng)物回腸黏膜固有層出現(xiàn)輕度水腫。給藥后第14對(duì)存活的動(dòng)物進(jìn)行大體解剖，各劑量組動(dòng)物胰腺、十二指腸、空腸及腸系膜、心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、胃、腦等主要臟器均未發(fā)現(xiàn)有異常改變。

3討論

凝血中形成的纖維蛋白，可經(jīng)纖溶酶作用從精氨酸-賴氨酸鍵上分解成可溶性產(chǎn)物，使血栓溶解。纖維蛋白溶解藥激活纖溶酶而促進(jìn)纖溶，也稱溶栓藥。其嚴(yán)重不良反應(yīng)為出血傾向，以注射或穿刺局部血腫最為常見(jiàn)，其次為組織內(nèi)出血。因?yàn)楸患せ畹睦w溶酶不但溶解病理性纖維蛋白，也溶解生理性的纖維蛋白［3］。

在本實(shí)驗(yàn)條件下，蛇毒纖維蛋白溶解酶單次靜脈注射的毒性癥狀與其他纖溶藥相同，有出血傾向，其毒性靶器官主要是胃、十二指腸、空腸、肺、胰，本藥未發(fā)現(xiàn)其他特異的癥狀。蛇毒纖維蛋白溶解酶毒性反應(yīng)集中在給藥后24h，中毒死亡時(shí)間集中在給藥后48h。NIH小鼠尾靜脈單次給藥的LD50為24783u/kg，95%可信限為21519～28823u/kg。

【參考文獻(xiàn)】

1化學(xué)藥物急性毒性試驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)原則課題研究組．化學(xué)藥物急性毒性試驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)原則,2005,3.

2袁伯俊，王治喬．新藥臨床前安全性評(píng)價(jià)與實(shí)踐．北京：軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)出版社，1997，27-28.

3楊藻宸.藥理學(xué)和藥物治療學(xué).北京：人民衛(wèi)生出版社,2000，1009-1011.