分子生物學(xué)進(jìn)展
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分子生物學(xué)進(jìn)展范文第1篇
關(guān)鍵詞:禽類防御素;分子生物學(xué);進(jìn)化;活性
中圖分類號(hào):S83 文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A 文章編號(hào):0529－5130(2016)01－0136－04
禽類防御素是一類內(nèi)源性陽(yáng)離子抗菌肽，在禽類先天性免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用。禽類防御素具有廣譜抗細(xì)菌、真菌和某些病毒的活性，是禽類抵抗外來(lái)致病性微生物侵襲的重要武器。據(jù)推測(cè)，由于禽類的異嗜性白細(xì)胞缺乏氧化機(jī)制，禽類可能更多依賴于防御素等抗菌肽類物質(zhì)來(lái)抵御感染［1］。目前，科研工作者們已從多種家禽和野禽體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了數(shù)十種防御素或其基因，并對(duì)部分禽類防御素的分子結(jié)構(gòu)、抗菌活性、抗病毒活性和組織表達(dá)特性等進(jìn)行了研究［2］。體外研究發(fā)現(xiàn)，除了抗微生物活性，某些禽類防御素還參與免疫調(diào)節(jié)和生殖活動(dòng)。近些年，國(guó)內(nèi)外對(duì)禽類防御素的研究報(bào)道不斷增多，下面對(duì)其分子生物學(xué)方面的研究進(jìn)展做一綜述。
1禽類防御素的分子結(jié)構(gòu)
從分子結(jié)構(gòu)劃分，目前已發(fā)現(xiàn)的所有禽類防御素均屬于β－防御素。因此，禽類防御素又被稱為禽β－防御素(avianbetadefensins，AvBDs)。AvBDs的前體由一個(gè)分泌型的信號(hào)肽和成熟肽構(gòu)成，許多AvBDs前體還有一個(gè)短的前片段(propiece)。前片段連接信號(hào)肽和成熟肽，通常被認(rèn)為起到抑制防御素的活性，防止其傷害宿主細(xì)胞的作用。少數(shù)AvBDs，例如雞AvBD3和AvBD11，在成熟肽的C末端還有一個(gè)后片段(post－piece)。后片段的作用尚不十分清楚。通過(guò)分析雞AvBD11的后片段發(fā)現(xiàn)其有3對(duì)二硫鍵結(jié)構(gòu)，因此人們推測(cè)雞AvBD11的后片段可能是基因復(fù)制過(guò)程中出現(xiàn)的多拷貝［3］。AvBDs的成熟肽部分是最終發(fā)揮生物學(xué)功能的成熟分子，通常由38～46個(gè)氨基酸構(gòu)成，大小為3～4ku。成熟肽具有β－折疊和α－螺旋結(jié)構(gòu)，分子內(nèi)有6對(duì)半胱氨酸形成的3對(duì)二硫鍵。二硫鍵對(duì)保證AvBDs的正確折疊和維持空間構(gòu)象具有重要作用。
2禽類防御素的基因進(jìn)化
研究發(fā)現(xiàn)，哺乳動(dòng)物的α－防御素基因簇位于β－防御素基因簇中，而少數(shù)靈長(zhǎng)類特有的θ－防御素基因位于α－防御素基因中［4］。這暗示α－防御素基因由β－防御素基因進(jìn)化而來(lái)，而θ－防御素基因又由α－防御素基因進(jìn)化而來(lái)。3種動(dòng)物防御素中，只有β－防御素是所有脊椎動(dòng)物所共有的，從低等的魚類到高等的哺乳類動(dòng)物都發(fā)現(xiàn)有β－防御素，而且β－防御素的氨基酸序列和結(jié)構(gòu)更接近于昆蟲等低等生物的防御素。進(jìn)化樹分析也發(fā)現(xiàn)，禽類防御素與哺乳動(dòng)物β－防御素的進(jìn)化關(guān)系近。這些研究表明，禽類和哺乳類動(dòng)物的防御素基因可能源自于它們共同的遠(yuǎn)古基因。禽類的基因組中有多個(gè)AvBD基因。根據(jù)雞的基因組測(cè)序結(jié)果，人們發(fā)現(xiàn)雞有14種防御素(Gal－1～Gal－14)，并通過(guò)生物信息學(xué)技術(shù)確定了這些防御素的基因序列。這14種防御素基因均位于3號(hào)染色體的末端，且成簇存在［5］。在其他禽類體內(nèi)也發(fā)現(xiàn)了多種AvBD基因。進(jìn)化樹分析表明，AvBD基因在鳥類分化前就已經(jīng)在進(jìn)化。禽類有許多同源AvBD基因，但有些AvBD基因也顯示出了一定的物種特異性，例如AvBD14目前只發(fā)現(xiàn)于雞?；谶M(jìn)化樹的分析顯示AvBD14可能由AvBD13的一個(gè)重復(fù)拷貝進(jìn)化而來(lái)。隨著斑胸草雀(zebrafinch)基因組測(cè)序的完成，人們對(duì)比分析了雞和斑胸草雀的β－防御素基因。基因組測(cè)序顯示斑胸草雀有22個(gè)β－防御素基因，其中的10個(gè)能在雞的基因組中找到同源基因，另外的12個(gè)基因可能由AvBD1或AvBD3演變而來(lái)，例如AvBD123和AvBD118［2］。多個(gè)防御素基因的存在可能對(duì)提高禽類的免疫防御能力具有幫助。對(duì)其他已發(fā)現(xiàn)的禽類(例如鴨、鵝、鵪鶉、鴿等)的防御素基因進(jìn)行分析也發(fā)現(xiàn)，同類禽防御素基因的同源性較高，但不同物種間仍有明顯差異，特別是防御素的成熟肽部分變化較大。和哺乳動(dòng)物的防御素一樣，禽類防御素的成熟肽很可能在正向選擇(positiveselec-tion)壓力下發(fā)生進(jìn)化［6］。在正向選擇壓力下，成熟肽的某些氨基酸變位點(diǎn)發(fā)生改變，生物學(xué)活性也隨之變化。
3禽類防御素的組織分布與表達(dá)調(diào)控
和動(dòng)物防御素一樣，禽類防御素主要來(lái)自骨髓源細(xì)胞或上皮細(xì)胞。例如雞AvBD1，2和4－7在骨髓源細(xì)胞中表達(dá)，而AvBD8－14主要由各種上皮細(xì)胞表達(dá)，當(dāng)然其他一些組織細(xì)胞也具有表達(dá)防御素的能力［7］。AvBDs在不同組織中的表達(dá)量不同。AvBD1，2，6和7在骨髓中表達(dá)量較高;AvBD1，2，6在法氏囊中表達(dá)量較高;AvBD13在脾臟中表達(dá)量較高。AvBD2在異嗜細(xì)胞中高表達(dá);AvBD1，2，6，10在呼吸道中表達(dá)量較高;AvBD9－12在腎臟中大量表達(dá)［3，8］。在禽類的生殖器官中也有防御素的大量表達(dá)，例如雞AvBD1，2，4，6在組織中高表達(dá)，可能暗示這些防御素與生殖活動(dòng)有關(guān)。某些人類β－防御素(例如DEFB126)被證實(shí)與生成有關(guān)［9］，是否禽類防御素也具有類似的功能還有待進(jìn)一步研究。除了組織差異外，禽類防御素的表達(dá)量也有種屬差異。例如有研究表明，AvBD10在鵪鶉骨髓中高表達(dá)，而在雞骨髓中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)高表達(dá)［10］。目前的研究表明，禽類防御素的表達(dá)受動(dòng)物生長(zhǎng)、感染、日糧成分和炎癥反應(yīng)等多種因素的調(diào)控。AvBD7在母雞的生長(zhǎng)過(guò)程中表達(dá)量逐漸增加直至性成熟，而AvBD14的表達(dá)則恰恰相反［11］。在雞性成熟后，多數(shù)AvBDs在附睪、陰道等處表達(dá)量升高［12］。蛋雞生殖道中防御素的表達(dá)受LPS和白介素的影響［13］。鴨感染鴨肝炎病毒后，肝臟中AvBD7的表達(dá)量上調(diào)，而AvBD12在多個(gè)器官中的表達(dá)量則下調(diào)［14］。日糧中維生素D3的含量能影響雞AvBD1的表達(dá)［2］;飼料中添加丁酸鹽能提高多數(shù)雞AvBDs的表達(dá)水平［15］。
4禽類防御素的生物學(xué)活性
4.1抗微生物活性
研究表明，大多數(shù)AvBDs顯示出良好的抗微生物活性。企鵝AvBD103b對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、星形奴卡菌等多種革蘭陽(yáng)性菌均具有殺滅作用［16］。雞AvBD9在2～4μmol/L濃度下即對(duì)多數(shù)革蘭陽(yáng)性菌和革蘭陰性菌具有抑制效果［8］。許多其他禽類防御素也具有廣譜抗菌活性(表1)。目前，關(guān)于AvBDs抗微生物機(jī)理研究較少。據(jù)推測(cè)，AvBDs可能與其他動(dòng)物的防御素一樣，能通過(guò)擾亂脂質(zhì)雙分子層等方式發(fā)揮抗病原微生物的作用。帶正電荷的AvBDs能與富含負(fù)電荷的細(xì)胞膜結(jié)合，然后將疏水性的肽段插入到脂質(zhì)雙分子層中，導(dǎo)致細(xì)胞膜通透性增加，最終達(dá)到殺菌目的。帶正電荷低的AvBDs通?？咕Ч草^差，這說(shuō)明AvBDs所帶電荷對(duì)其抗菌非常重要。研究還發(fā)現(xiàn)，AvBDs的二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)殺菌同樣重要。缺少二硫鍵的線性AvBD2分子殺菌效果降低，無(wú)法有效殺滅金黃色葡萄球菌，但對(duì)大腸桿菌仍具有殺菌效果［17］。許多AvBDs的抗菌活性受鹽離子濃度、pH值等理化因素的影響［8，14］。高鹽條件下(例如氯化鈉濃度達(dá)到150mmol/L)，AvBDs的抗菌活性往往會(huì)受到抑制。
4.2抗病毒活性
已報(bào)道，某些AvBDs對(duì)病毒具有抑制作用。鴨AvBD1、AvBD3、AvBD6等能抑制鴨肝炎病毒(DHV)的增殖，延長(zhǎng)鴨胚接毒后的存活時(shí)間［21］。雞胚成纖維細(xì)胞感染流感血凝素重組痘病毒后，AvBD4、AvBD6的表達(dá)量會(huì)升高［25］。體外試驗(yàn)表明，雞AvBD2、AvBD6和AvBD12具有抑制傳染性支氣管炎病毒的作用［26］。
4.3免疫調(diào)節(jié)作用
除了抗微生物活性外，AvBDs在禽類體內(nèi)還發(fā)揮著多種免疫調(diào)節(jié)作用，例如趨化作用和細(xì)胞分化。有研究表明，雞AvBD13對(duì)LPS處理的脾臟淋巴細(xì)胞的增殖分化具有促進(jìn)作用［27］。鴨AvBD2能趨化DT40B淋巴細(xì)胞、CD4+T淋巴細(xì)胞等［19］。
4.4在禽類生殖中的作用
近些年的研究表明，某些AvBDs在生殖器官中大量表達(dá)，可能與禽類的生殖有密切關(guān)系。從現(xiàn)有的研究結(jié)果來(lái)看，AvBDs在生殖器管中的表達(dá)可能有兩方面的作用:一方面，參與生殖系統(tǒng)的抗感染，構(gòu)成生殖系統(tǒng)抗感染的重要防線;另一方面，可能參與了禽類的生殖細(xì)胞分化，并維持生殖細(xì)胞的正常活力。雞AvBD1、AvBD2等9種防御素在組織中有表達(dá)，其中一些防御素在公雞性成熟過(guò)程中表達(dá)量上升［28］。母雞感染沙門菌后，AvBD5、AvBD7等防御素在陰道中的表達(dá)量上調(diào)［29］。公雞感染沙門菌后，AvBD10、AvBD12、AvBD14在中的表達(dá)量上調(diào)［30］。
5展望
分子生物學(xué)進(jìn)展范文第2篇
【關(guān)鍵詞】HIV病毒；分子生物學(xué)檢測(cè)；進(jìn)展
艾滋病病毒（HIV）主要侵襲人體免疫系統(tǒng)，導(dǎo)致人體免疫缺陷發(fā)生多種感染疾病或腫瘤。艾滋病的不可治愈及其快速傳播使患者不斷增多，2012年全球感染總?cè)藬?shù)已達(dá)3900萬(wàn)人，中國(guó)近半艾滋病病毒感染者尚未發(fā)現(xiàn)，為了防止艾滋病的大規(guī)模流行，艾滋病的檢測(cè)工作越發(fā)重要。目前篩查的免疫學(xué)方法，由于靈敏度低，漏檢窗口期和新近感染病毒的感染者，而以核酸檢測(cè)為代表的分子生物學(xué)技術(shù)，靈敏度和特異性均顯著提高，明顯縮短檢出病原體的窗口期，是HIV診斷方法和診斷試劑持續(xù)發(fā)展的主要方向，對(duì)遏制艾滋病的傳播蔓延有重要意義。
1 HIV生物學(xué)特性
HIV呈圓形或橢圓形，直徑900～140nm，外層為類脂包膜，成分是外膜糖蛋白（gp120）和跨膜糖蛋白（gp41），核心由RNA逆轉(zhuǎn)錄酶、DNA多聚酶和結(jié)構(gòu)蛋白等組成，基因組除了具有逆轉(zhuǎn)錄病毒的基本結(jié)構(gòu)——基因長(zhǎng)末端重復(fù)序列（LTR）、核心蛋白（gag）、聚合蛋白（po1）、包膜蛋白（env）gF，還有非常復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制，包括tat、rev、nef、vif、vpr、vpu等調(diào)節(jié)基因，其作用是在轉(zhuǎn)錄、翻譯、裝配等各個(gè)環(huán)節(jié)對(duì)病毒的生長(zhǎng)和繁殖起調(diào)節(jié)作用。HIV基因組中存在3個(gè)gag-pol- env.Gag基因編碼的核心蛋白均位于病毒的核酸蛋白體上，P17位于白與殼層之間的基質(zhì)上，包被于包膜蛋白的內(nèi)部。核衣殼包被于內(nèi)部核酸的，由主要的P24和P40及P55組成，其結(jié)構(gòu)比較穩(wěn)定，是HIV-1型的特異性蛋白。Env編碼包膜蛋白即gp120和gp41，起協(xié)助HIV進(jìn)入宿主細(xì)胞的作用。聚合酶蛋白包括P66、P51和P31，它位于病毒的核區(qū)內(nèi)，并與病毒核酸緊密相關(guān)[1]。
根據(jù)env基因V3段堿基排列的不同，HIV-1分為11個(gè)亞型即A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、M和0亞型，HIV-2分為6個(gè)亞型[2]，不同國(guó)家和地區(qū)有相對(duì)優(yōu)勢(shì)亞型，HIV亞型在流行病學(xué)、診斷、臨床、試劑選擇、藥物篩選和疫苗研制上有著重要意義。
2 HIV-1的感染機(jī)制及感染標(biāo)志
病毒侵入人體后，通過(guò)病毒表面gpl20在化學(xué)因子CCR5或CXCR4幫助下與細(xì)胞表面受體CD4分子結(jié)合，然后在gp41的協(xié)助下HIV的膜與CD4+細(xì)胞的細(xì)胞膜相融合，病毒核心蛋白及RNA進(jìn)入胞漿。兩條RNA+在逆轉(zhuǎn)錄酶作用下成DNA-，在DNA多聚酶的作用下復(fù)制DNA，此DNA部分存留在胞漿內(nèi)產(chǎn)生系列變化，然后在細(xì)胞膜上裝配成新病毒，再感染其它細(xì)胞。HIV感染后，首先能夠監(jiān)測(cè)到病毒RNA，其次是p24抗原，最后是抗體[3]。
3 分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)
隨著分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)快速發(fā)展，HIV RNA或DNA檢測(cè)得到應(yīng)用，核酸檢測(cè)已是艾滋病實(shí)驗(yàn)室診斷的主要發(fā)展方向[4]，在HIV感染的監(jiān)測(cè)、診斷、研究、療效觀察及預(yù)后判斷等方面均發(fā)揮著越來(lái)越大的作用，主要有定性和定量?jī)深悺?/p>
3.2 定性檢測(cè)
3.2.1 原位雜交（insite hydzmion）
應(yīng)用特定的標(biāo)記探針以分子雜交法直接檢測(cè)標(biāo)本中的HIV病毒靶核酸，起初標(biāo)記探針是放射性標(biāo)記，后來(lái)逐漸發(fā)展為酶標(biāo)記或化學(xué)發(fā)光標(biāo)記等等。原位雜交的陽(yáng)性率比聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）略低，隨著核酸擴(kuò)增技術(shù)的出現(xiàn)并廣泛使用，基因探針技術(shù)也就逐漸失去應(yīng)用意義。
3.2.2 聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)（PCR）
PCR是一種以核酸生物學(xué)為基礎(chǔ)的分子生物學(xué)診斷技術(shù)?；驹眍愃朴贒NA的天然復(fù)制過(guò)程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。PCR由變性—退火—延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成?；颊吒腥綡IV 1～14d后血漿中能檢測(cè)出HIV RNA，可用于急性感染期患者、抗體檢測(cè)不確定等情況的輔助診斷或用于血液篩查，尤其在HIV陽(yáng)性母親產(chǎn)下的嬰兒是否感染HIV的診斷中有著非常重要的意義，前病毒DNA PCR檢測(cè)法對(duì)出生48h內(nèi)的嬰兒檢測(cè)敏感性為38%，出生14d的嬰兒檢測(cè)敏感性達(dá)93%[5]。
3.2.3 逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)技術(shù)（RT-PCR）
RT-PCR技術(shù)通過(guò)對(duì)RNA逆轉(zhuǎn)錄酶的應(yīng)用實(shí)現(xiàn)，即將病毒RNA逆轉(zhuǎn)錄DNA，接著進(jìn)行PCR，指數(shù)擴(kuò)增DN段，將放大產(chǎn)物變性并與多孔板結(jié)合，利用酶聯(lián)系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)。RT-PCR技術(shù)可在2h內(nèi)擴(kuò)增產(chǎn)物達(dá)到凝膠電泳或?qū)崟r(shí)熒光法可檢測(cè)的水平，準(zhǔn)確定量的RT-PCR方法已被許多商業(yè)實(shí)驗(yàn)室證實(shí)，目前多種改良的快速RT-PCR檢測(cè)方法應(yīng)用于HIV的快速臨床診斷[6，7]。
PCR靈敏度高、特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)便，但易污染出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果；此外，HIV基因的多樣性，尚無(wú)一套引物能夠覆蓋所有的HIV序列，限制了檢測(cè)敏感性，因此，陽(yáng)性結(jié)果還須核酸序列測(cè)定加以確認(rèn)。HIV核酸定性檢測(cè)陽(yáng)性結(jié)果可作為HIV 抗體窗口期的早期診斷的輔助指標(biāo)，但不能單獨(dú)用于HIV感染的確診，成為限制PCR對(duì)于HIV感染診斷的臨床應(yīng)用。
3.3 定量檢測(cè)
HIV核酸定量檢測(cè)即病毒載量測(cè)定，感染HIV后病情發(fā)展速度直接與血漿中病毒載量呈正比。在其他血清學(xué)和病毒學(xué)標(biāo)志出現(xiàn)前檢出病毒核酸，使窗口期縮短6～11.5d，且慢性潛伏期也能檢出，便于早期輔助診斷；HIV病毒載量常用于用于評(píng)估疾病病程、監(jiān)測(cè)抗病毒治療成效、選擇抗病毒治療方案；還可用于鑒定出生后18個(gè)月內(nèi)的嬰兒血液中的HIV-IgG抗體是否來(lái)自于母體，嬰兒是否感染HIV（母嬰診斷）。當(dāng)前，常用的定量檢測(cè)方法有較高的敏感性、特異性和可重復(fù)性。
3.3.1 分支DNA信號(hào)擴(kuò)大系統(tǒng)（bDNA）
bDNA是指人工合成帶有側(cè)鏈的DN段標(biāo)記被激發(fā)的標(biāo)記物，利用發(fā)光強(qiáng)度與樣品中HIV RNA含量成比例，可通過(guò)發(fā)光強(qiáng)度來(lái)定量檢測(cè)血漿中HIV-1型RNA的一種方法。bDNA作為一種定量核酸檢測(cè)方法具有對(duì)檢測(cè)靶序列變異的更強(qiáng)識(shí)別能力，目前發(fā)展到靈敏度更好的、具有靶序列放大系統(tǒng)的第三代bDNA有數(shù)十個(gè)覆蓋整個(gè)基因組的探針，不僅可用于檢測(cè)HIV感染，可以方便地檢測(cè)HIV的部分變異株，且可用于療效觀察，文獻(xiàn)報(bào)道其為一種高靈敏度及特異性的方法[8，9]。與PCR相比bDNA不存在擴(kuò)增物的交叉污染，但靈敏度不如PCR，提高bDNA的靈敏度仍是難點(diǎn)[10]。
3.3.2 核酸序列依賴的擴(kuò)增系統(tǒng)（NASBA）
NASBA是以RT-PCR為基礎(chǔ)，由一對(duì)引物介導(dǎo)的、連續(xù)均一的、體外特異性核苷酸序列等溫?cái)U(kuò)增RNA的新技術(shù)，原理是提取病毒RNA，加入AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、核酸酶H（Rnase H）、T7RNA聚合酶和引物進(jìn)行擴(kuò)增。NASBA無(wú)需熱循環(huán)裝置，只在一個(gè)溫度下進(jìn)行（42℃），即可擴(kuò)增大量拷貝的RN段。對(duì)不同條件的實(shí)驗(yàn)室可以一次擴(kuò)增足量的RNA用于多次研究和直接使用肝素抗凝的血漿樣品，適合凍存血漿的回顧性分析。其高效擴(kuò)增的特性，能與多孔板酶介導(dǎo)的顯像技術(shù)及實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)結(jié)合。因擴(kuò)增產(chǎn)物的不穩(wěn)定性特征，對(duì)傳染病病原的定性、定量檢測(cè)，減少了分子診斷實(shí)驗(yàn)室擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染。但操作較繁瑣，不便于大批量處理，且擴(kuò)增時(shí)退火溫度較低，容易引起污染，當(dāng)前，NASBA已應(yīng)用于HIV-1的分子診斷[10]。
3.3.3 轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增系統(tǒng)（TMA）
TMA技術(shù)原理與NASBA大致相同，差別是TMA利用MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶及T7 RNA聚合酶兩種酶，MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶既有逆轉(zhuǎn)錄酶的活性又具有RNA酶H活性，反應(yīng)溫度為41.5℃，1h內(nèi)RNA模板擴(kuò)增約109倍。相比p24抗原檢測(cè)，TMA技術(shù)可縮短窗口期6 d，比HIV抗體檢測(cè)縮短14 d [11]。
3.3.4 連接酶酶促鏈?zhǔn)椒磻?yīng) （LCR）
LCR法是基于靶分子依賴的寡核苷酸探針相互連接的一種探針擴(kuò)增技術(shù)，原理是由兩段數(shù)l0個(gè)核苷酸組成的單鏈DNA探針與目標(biāo)序列雜交，將被檢測(cè)物中的特異性片段進(jìn)行擴(kuò)增，檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。LCR既可擴(kuò)增，又可檢測(cè)DNA突變，對(duì)已知突變類型的基因診斷是一個(gè)切實(shí)有效可行的方法，是隨PCR后一種較有發(fā)展前景的體外擴(kuò)增新技術(shù)。
3.3.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)
實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的應(yīng)用使HIV核酸檢測(cè)技術(shù)又進(jìn)入到一個(gè)新境界。原理是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析。一般使用TaqMan探針或Sybr Green熒光染料。但Sybr Green染料不能區(qū)別目的產(chǎn)物和非目的產(chǎn)物，使結(jié)果有偏差，目前廣泛使用的是TaqMan探針技術(shù)。熒光實(shí)時(shí)PCR則可以進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)，改變了傳統(tǒng)的電泳終點(diǎn)檢測(cè)，得到相應(yīng)的S型擴(kuò)增曲線，其不但可以進(jìn)行定性檢測(cè)，更重要的是可以進(jìn)行定量檢測(cè)。與常規(guī)相比，具有特異性強(qiáng)、自動(dòng)化程度高、有效解決污染問(wèn)題等特點(diǎn)，能夠檢測(cè)血漿中的病毒載量及血液中單個(gè)核細(xì)胞的前病毒載量。美國(guó)PE公司1996年發(fā)明TaqMan技術(shù)[12]，已廣泛應(yīng)用于基因檢測(cè)， 國(guó)內(nèi)2002年4月深圳匹基公司獲批準(zhǔn)第一個(gè)生產(chǎn)HIV熒光PCR檢測(cè)試劑盒，并應(yīng)用于臨床診斷，國(guó)產(chǎn)實(shí)時(shí)熒光RT-PCR試劑檢測(cè)HIV-1血漿病毒載量與進(jìn)口試劑相比具有較好的相關(guān)性[13]，并具有價(jià)格低廉的優(yōu)勢(shì)，已在臨床逐步推廣應(yīng)用。
3.3.6 PCR-ELISA
PCR-ELISA技術(shù)是PCR擴(kuò)增以后，在微孔板上借用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）的原理，使用酶標(biāo)抗體，進(jìn)行固相雜交來(lái)實(shí)現(xiàn)定量。該技術(shù)是一種具有很高靈敏度和特異性的方法[14]，但ELISA是一個(gè)開放性的反應(yīng)，擴(kuò)增后進(jìn)行ELISA反應(yīng)，容易產(chǎn)生污染引起假陽(yáng)性，同時(shí)操作過(guò)程較繁瑣，臨床上難以廣泛應(yīng)用。
3.3.7 基因芯片技術(shù)
是PCR技術(shù)與核酸分子雜交相結(jié)合，通過(guò)對(duì)HIV基因組分析，將該病毒的高度保守序列作為鑒定指標(biāo)，可直接對(duì)病毒病原體進(jìn)行檢測(cè)，顯著提高了診斷的準(zhǔn)確性。1996年，Kozal等[15]研制出一種DNA芯片，對(duì)HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶及蛋白酶的基因突變進(jìn)行篩選，并跟蹤監(jiān)測(cè)HIV拮抗藥物的產(chǎn)生和突變、疾病相關(guān)基因型以及患者在治療中的反應(yīng)。1998年，Hauser等[16]應(yīng)用DNA芯片技術(shù)在艾滋病患者出現(xiàn)抗體反應(yīng)前檢測(cè)HIV，對(duì)艾滋病的早期診斷有十分重要的意義。Affy-nletrix公司和Roche Mo1ecular公司合作生產(chǎn)的新一代診斷試劑盒，利用RMS實(shí)驗(yàn)室的PCR擴(kuò)增技術(shù)和DNA芯片技術(shù)結(jié)合檢測(cè)艾滋病患者的HIV耐藥反應(yīng)。HIV PRT440也已廣泛用于HIV-l病毒的測(cè)序、分型及多態(tài)性分析[17] ?；虮磉_(dá)譜研究可以高通量在檢測(cè)基因表達(dá)信息[18]。國(guó)內(nèi)也有文獻(xiàn)報(bào)道采用基因芯片檢測(cè)HIV[19，20] 。由此可見，基因芯片在鑒定HIV感染中具有其他方法無(wú)可比擬的優(yōu)越性。
盡管基因芯片技術(shù)需要進(jìn)一步的不斷完善，但完全可以預(yù)計(jì)在不久的將來(lái)其應(yīng)用前景會(huì)錦上添花。不單限于HIV的耐藥性檢測(cè)和基因診斷，可以讓許多感染性疾病病原體的基因集中在一張芯片上，同時(shí)對(duì)其進(jìn)行感染診斷。
總之，分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)有助于HIV感染者的早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療，也有助于對(duì)治療艾滋病藥物的療效評(píng)價(jià)、預(yù)測(cè)和監(jiān)測(cè)疾病進(jìn)程，減少艾滋病對(duì)個(gè)人、家庭及社會(huì)的危害。隨著HIV分子生物學(xué)技術(shù)在高特異性、高敏感性、快速、自動(dòng)化等方面的不斷進(jìn)步，HIV分子診斷可望成為艾滋病診斷標(biāo)準(zhǔn)之一，并通過(guò)對(duì)HIV突變及個(gè)體遺傳差異的檢測(cè)指導(dǎo)抗病毒治療，為人類遏止艾滋病的流行發(fā)揮重要的作用。
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艾滋病病毒（HIV）主要侵襲人體免疫系統(tǒng)，導(dǎo)致人體免疫缺陷發(fā)生多種感染疾病或腫瘤。艾滋病的不可治愈及其快速傳播使患者不斷增多，2012年全球感染總?cè)藬?shù)已達(dá)3900萬(wàn)人，中國(guó)近半艾滋病病毒感染者尚未發(fā)現(xiàn)，為了防止艾滋病的大規(guī)模流行，艾滋病的檢測(cè)工作越發(fā)重要。目前篩查的免疫學(xué)方法，由于靈敏度低，漏檢窗口期和新近感染病毒的感染者，而以核酸檢測(cè)為代表的分子生物學(xué)技術(shù)，靈敏度和特異性均顯著提高，明顯縮短檢出病原體的窗口期，是HIV診斷方法和診斷試劑持續(xù)發(fā)展的主要方向，對(duì)遏制艾滋病的傳播蔓延有重要意義。
1 HIV生物學(xué)特性
HIV呈圓形或橢圓形，直徑900～140nm，外層為類脂包膜，成分是外膜糖蛋白（gp120）和跨膜糖蛋白（gp41），核心由RNA逆轉(zhuǎn)錄酶、DNA多聚酶和結(jié)構(gòu)蛋白等組成，基因組除了具有逆轉(zhuǎn)錄病毒的基本結(jié)構(gòu)——基因長(zhǎng)末端重復(fù)序列（LTR）、核心蛋白（gag）、聚合蛋白（po1）、包膜蛋白（env）gF，還有非常復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制，包括tat、rev、nef、vif、vpr、vpu等調(diào)節(jié)基因，其作用是在轉(zhuǎn)錄、翻譯、裝配等各個(gè)環(huán)節(jié)對(duì)病毒的生長(zhǎng)和繁殖起調(diào)節(jié)作用。HIV基因組中存在3個(gè)gag-pol- env.Gag基因編碼的核心蛋白均位于病毒的核酸蛋白體上，P17位于白與殼層之間的基質(zhì)上，包被于包膜蛋白的內(nèi)部。核衣殼包被于內(nèi)部核酸的，由主要的P24和P40及P55組成，其結(jié)構(gòu)比較穩(wěn)定，是HIV-1型的特異性蛋白。Env編碼包膜蛋白即gp120和gp41，起協(xié)助HIV進(jìn)入宿主細(xì)胞的作用。聚合酶蛋白包括P66、P51和P31，它位于病毒的核區(qū)內(nèi)，并與病毒核酸緊密相關(guān)[1]。
根據(jù)env基因V3段堿基排列的不同，HIV-1分為11個(gè)亞型即A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、M和0亞型，HIV-2分為6個(gè)亞型[2]，不同國(guó)家和地區(qū)有相對(duì)優(yōu)勢(shì)亞型，HIV亞型在流行病學(xué)、診斷、臨床、試劑選擇、藥物篩選和疫苗研制上有著重要意義。
2 HIV-1的感染機(jī)制及感染標(biāo)志
病毒侵入人體后，通過(guò)病毒表面gpl20在化學(xué)因子CCR5或CXCR4幫助下與細(xì)胞表面受體CD4分子結(jié)合，然后在gp41的協(xié)助下HIV的膜與CD4+細(xì)胞的細(xì)胞膜相融合，病毒核心蛋白及RNA進(jìn)入胞漿。兩條RNA+在逆轉(zhuǎn)錄酶作用下成DNA-，在DNA多聚酶的作用下復(fù)制DNA，此DNA部分存留在胞漿內(nèi)產(chǎn)生系列變化，然后在細(xì)胞膜上裝配成新病毒，再感染其它細(xì)胞。HIV感染后，首先能夠監(jiān)測(cè)到病毒RNA，其次是p24抗原，最后是抗體[3]。
3 分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)
隨著分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)快速發(fā)展，HIV RNA或DNA檢測(cè)得到應(yīng)用，核酸檢測(cè)已是艾滋病實(shí)驗(yàn)室診斷的主要發(fā)展方向[4]，在HIV感染的監(jiān)測(cè)、診斷、研究、療效觀察及預(yù)后判斷等方面均發(fā)揮著越來(lái)越大的作用，主要有定性和定量?jī)深悺?/p>
3.2 定性檢測(cè)
3.2.1 原位雜交（insite hydzmion）
應(yīng)用特定的標(biāo)記探針以分子雜交法直接檢測(cè)標(biāo)本中的HIV病毒靶核酸，起初標(biāo)記探針是放射性標(biāo)記，后來(lái)逐漸發(fā)展為酶標(biāo)記或化學(xué)發(fā)光標(biāo)記等等。原位雜交的陽(yáng)性率比聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）略低，隨著核酸擴(kuò)增技術(shù)的出現(xiàn)并廣泛使用，基因探針技術(shù)也就逐漸失去應(yīng)用意義。
3.2.2 聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)（PCR）
PCR是一種以核酸生物學(xué)為基礎(chǔ)的分子生物學(xué)診斷技術(shù)?；驹眍愃朴贒NA的天然復(fù)制過(guò)程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。PCR由變性—退火—延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成?；颊吒腥綡IV 1～14d后血漿中能檢測(cè)出HIV RNA，可用于急性感染期患者、抗體檢測(cè)不確定等情況的輔助診斷或用于血液篩查，尤其在HIV陽(yáng)性母親產(chǎn)下的嬰兒是否感染HIV的診斷中有著非常重要的意義，前病毒DNA PCR檢測(cè)法對(duì)出生48h內(nèi)的嬰兒檢測(cè)敏感性為38%，出生14d的嬰兒檢測(cè)敏感性達(dá)93%[5]。
3.2.3 逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)技術(shù)（RT-PCR）
RT-PCR技術(shù)通過(guò)對(duì)RNA逆轉(zhuǎn)錄酶的應(yīng)用實(shí)現(xiàn)，即將病毒RNA逆轉(zhuǎn)錄DNA，接著進(jìn)行PCR，指數(shù)擴(kuò)增DN段，將放大產(chǎn)物變性并與多孔板結(jié)合，利用酶聯(lián)系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)。RT-PCR技術(shù)可在2h內(nèi)擴(kuò)增產(chǎn)物達(dá)到凝膠電泳或?qū)崟r(shí)熒光法可檢測(cè)的水平，準(zhǔn)確定量的RT-PCR方法已被許多商業(yè)實(shí)驗(yàn)室證實(shí)，目前多種改良的快速RT-PCR檢測(cè)方法應(yīng)用于HIV的快速臨床診斷[6，7]。
PCR靈敏度高、特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)便，但易污染出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果；此外，HIV基因的多樣性，尚無(wú)一套引物能夠覆蓋所有的HIV序列，限制了檢測(cè)敏感性，因此，陽(yáng)性結(jié)果還須核酸序列測(cè)定加以確認(rèn)。HIV核酸定性檢測(cè)陽(yáng)性結(jié)果可作為HIV 抗體窗口期的早期診斷的輔助指標(biāo)，但不能單獨(dú)用于HIV感染的確診，成為限制PCR對(duì)于HIV感染診斷的臨床應(yīng)用。
3.3 定量檢測(cè)
HIV核酸定量檢測(cè)即病毒載量測(cè)定，感染HIV后病情發(fā)展速度直接與血漿中病毒載量呈正比。在其他血清學(xué)和病毒學(xué)標(biāo)志出現(xiàn)前檢出病毒核酸，使窗口期縮短6～11.5d，且慢性潛伏期也能檢出，便于早期輔助診斷；HIV病毒載量常用于用于評(píng)估疾病病程、監(jiān)測(cè)抗病毒治療成效、選擇抗病毒治療方案；還可用于鑒定出生后18個(gè)月內(nèi)的嬰兒血液中的HIV-IgG抗體是否來(lái)自于母體，嬰兒是否感染HIV（母嬰診斷）。當(dāng)前，常用的定量檢測(cè)方法有較高的敏感性、特異性和可重復(fù)性。
3.3.1 分支DNA信號(hào)擴(kuò)大系統(tǒng)（bDNA）
bDNA是指人工合成帶有側(cè)鏈的DN段標(biāo)記被激發(fā)的標(biāo)記物，利用發(fā)光強(qiáng)度與樣品中HIV RNA含量成比例，可通過(guò)發(fā)光強(qiáng)度來(lái)定量檢測(cè)血漿中HIV-1型RNA的一種方法。bDNA作為一種定量核酸檢測(cè)方法具有對(duì)檢測(cè)靶序列變異的更強(qiáng)識(shí)別能力，目前發(fā)展到靈敏度更好的、具有靶序列放大系統(tǒng)的第三代bDNA有數(shù)十個(gè)覆蓋整個(gè)基因組的探針，不僅可用于檢測(cè)HIV感染，可以方便地檢測(cè)HIV的部分變異株，且可用于療效觀察，文獻(xiàn)報(bào)道其為一種高靈敏度及特異性的方法[8，9]。與PCR相比bDNA不存在擴(kuò)增物的交叉污染，但靈敏度不如PCR，提高bDNA的靈敏度仍是難點(diǎn)[10]。
3.3.2 核酸序列依賴的擴(kuò)增系統(tǒng)（NASBA）
NASBA是以RT-PCR為基礎(chǔ)，由一對(duì)引物介導(dǎo)的、連續(xù)均一的、體外特異性核苷酸序列等溫?cái)U(kuò)增RNA的新技術(shù)，原理是提取病毒RNA，加入AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、核酸酶H（Rnase H）、T7RNA聚合酶和引物進(jìn)行擴(kuò)增。NASBA無(wú)需熱循環(huán)裝置，只在一個(gè)溫度下進(jìn)行（42℃），即可擴(kuò)增大量拷貝的RN段。對(duì)不同條件的實(shí)驗(yàn)室可以一次擴(kuò)增足量的RNA用于多次研究和直接使用肝素抗凝的血漿樣品，適合凍存血漿的回顧性分析。其高效擴(kuò)增的特性，能與多孔板酶介導(dǎo)的顯像技術(shù)及實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)結(jié)合。因擴(kuò)增產(chǎn)物的不穩(wěn)定性特征，對(duì)傳染病病原的定性、定量檢測(cè)，減少了分子診斷實(shí)驗(yàn)室擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染。但操作較繁瑣，不便于大批量處理，且擴(kuò)增時(shí)退火溫度較低，容易引起污染，當(dāng)前，NASBA已應(yīng)用于HIV-1的分子診斷[10]。
3.3.3 轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增系統(tǒng)（TMA）
TMA技術(shù)原理與NASBA大致相同，差別是TMA利用MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶及T7 RNA聚合酶兩種酶，MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶既有逆轉(zhuǎn)錄酶的活性又具有RNA酶H活性，反應(yīng)溫度為41.5℃，1h內(nèi)RNA模板擴(kuò)增約109倍。相比p24抗原檢測(cè)，TMA技術(shù)可縮短窗口期6 d，比HIV抗體檢測(cè)縮短14 d [11]。
3.3.4 連接酶酶促鏈?zhǔn)椒磻?yīng) （LCR）
LCR法是基于靶分子依賴的寡核苷酸探針相互連接的一種探針擴(kuò)增技術(shù)，原理是由兩段數(shù)l0個(gè)核苷酸組成的單鏈DNA探針與目標(biāo)序列雜交，將被檢測(cè)物中的特異性片段進(jìn)行擴(kuò)增，檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。LCR既可擴(kuò)增，又可檢測(cè)DNA突變，對(duì)已知突變類型的基因診斷是一個(gè)切實(shí)有效可行的方法，是隨PCR后一種較有發(fā)展前景的體外擴(kuò)增新技術(shù)。
3.3.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)
實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的應(yīng)用使HIV核酸檢測(cè)技術(shù)又進(jìn)入到一個(gè)新境界。原理是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析。一般使用TaqMan探針或Sybr Green熒光染料。但Sybr Green染料不能區(qū)別目的產(chǎn)物和非目的產(chǎn)物，使結(jié)果有偏差，目前廣泛使用的是TaqMan探針技術(shù)。熒光實(shí)時(shí)PCR則可以進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)，改變了傳統(tǒng)的電泳終點(diǎn)檢測(cè)，得到相應(yīng)的S型擴(kuò)增曲線，其不但可以進(jìn)行定性檢測(cè)，更重要的是可以進(jìn)行定量檢測(cè)。與常規(guī)相比，具有特異性強(qiáng)、自動(dòng)化程度高、有效解決污染問(wèn)題等特點(diǎn)，能夠檢測(cè)血漿中的病毒載量及血液中單個(gè)核細(xì)胞的前病毒載量。美國(guó)PE公司1996年發(fā)明TaqMan技術(shù)[12]，已廣泛應(yīng)用于基因檢測(cè)， 國(guó)內(nèi)2002年4月深圳匹基公司獲批準(zhǔn)第一個(gè)生產(chǎn)HIV熒光PCR檢測(cè)試劑盒，并應(yīng)用于臨床診斷，國(guó)產(chǎn)實(shí)時(shí)熒光RT-PCR試劑檢測(cè)HIV-1血漿病毒載量與進(jìn)口試劑相比具有較好的相關(guān)性[13]，并具有價(jià)格低廉的優(yōu)勢(shì)，已在臨床逐步推廣應(yīng)用。
3.3.6 PCR-ELISA
PCR-ELISA技術(shù)是PCR擴(kuò)增以后，在微孔板上借用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）的原理，使用酶標(biāo)抗體，進(jìn)行固相雜交來(lái)實(shí)現(xiàn)定量。該技術(shù)是一種具有很高靈敏度和特異性的方法[14]，但ELISA是一個(gè)開放性的反應(yīng)，擴(kuò)增后進(jìn)行ELISA反應(yīng)，容易產(chǎn)生污染引起假陽(yáng)性，同時(shí)操作過(guò)程較繁瑣，臨床上難以廣泛應(yīng)用。
3.3.7 基因芯片技術(shù)
是PCR技術(shù)與核酸分子雜交相結(jié)合，通過(guò)對(duì)HIV基因組分析，將該病毒的高度保守序列作為鑒定指標(biāo)，可直接對(duì)病毒病原體進(jìn)行檢測(cè)，顯著提高了診斷的準(zhǔn)確性。1996年，Kozal等[15]研制出一種DNA芯片，對(duì)HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶及蛋白酶的基因突變進(jìn)行篩選，并跟蹤監(jiān)測(cè)HIV拮抗藥物的產(chǎn)生和突變、疾病相關(guān)基因型以及患者在治療中的反應(yīng)。1998年，Hauser等[16]應(yīng)用DNA芯片技術(shù)在艾滋病患者出現(xiàn)抗體反應(yīng)前檢測(cè)HIV，對(duì)艾滋病的早期診斷有十分重要的意義。Affy-nletrix公司和Roche Mo1ecular公司合作生產(chǎn)的新一代診斷試劑盒，利用RMS實(shí)驗(yàn)室的PCR擴(kuò)增技術(shù)和DNA芯片技術(shù)結(jié)合檢測(cè)艾滋病患者的HIV耐藥反應(yīng)。HIV PRT440也已廣泛用于HIV-l病毒的測(cè)序、分型及多態(tài)性分析[17] ?；虮磉_(dá)譜研究可以高通量在檢測(cè)基因表達(dá)信息[18]。國(guó)內(nèi)也有文獻(xiàn)報(bào)道采用基因芯片檢測(cè)HIV[19，20] 。由此可見，基因芯片在鑒定HIV感染中具有其他方法無(wú)可比擬的優(yōu)越性。
盡管基因芯片技術(shù)需要進(jìn)一步的不斷完善，但完全可以預(yù)計(jì)在不久的將來(lái)其應(yīng)用前景會(huì)錦上添花。不單限于HIV的耐藥性檢測(cè)和基因診斷，可以讓許多感染性疾病病原體的基因集中在一張芯片上，同時(shí)對(duì)其進(jìn)行感染診斷。
總之，分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)有助于HIV感染者的早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療，也有助于對(duì)治療艾滋病藥物的療效評(píng)價(jià)、預(yù)測(cè)和監(jiān)測(cè)疾病進(jìn)程，減少艾滋病對(duì)個(gè)人、家庭及社會(huì)的危害。隨著HIV分子生物學(xué)技術(shù)在高特異性、高敏感性、快速、自動(dòng)化等方面的不斷進(jìn)步，HIV分子診斷可望成為艾滋病診斷標(biāo)準(zhǔn)之一，并通過(guò)對(duì)HIV突變及個(gè)體遺傳差異的檢測(cè)指導(dǎo)抗病毒治療，為人類遏止艾滋病的流行發(fā)揮重要的作用。
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分子生物學(xué)進(jìn)展范文第3篇
摘要 瑞氏木霉是自然界中普遍存在并有重要經(jīng)濟(jì)意義的一種絲狀真菌，作為工業(yè)生產(chǎn)菌株生產(chǎn)多種水解酶類已有多年歷史。本文報(bào)道了用基因工程手段對(duì)瑞氏木霉進(jìn)行遺傳改造，構(gòu)造具新性狀的重組菌株，用以過(guò)量產(chǎn)生同源和異源蛋白類物質(zhì)的分子生物學(xué)研究進(jìn)展。包括利用CBHI基因的強(qiáng)啟動(dòng)子在瑞氏木霉中過(guò)量表達(dá)瑞氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶、小牛凝乳蛋白酶、人抗體片段、哈茨木霉幾丁質(zhì)酶、Hormoconis葡萄糖淀粉酶等同源和異源蛋白以及利用在葡萄糖上強(qiáng)表達(dá)的啟動(dòng)子生產(chǎn)纖維素酶等遺傳工程進(jìn)行情況。
關(guān)鍵詞瑞氏木霉；遺傳改造；基因定位置換整合；重組蛋白
1 前言
多年以來(lái)，絲狀真菌及其產(chǎn)生的酶類已廣泛用于食品和食品加工業(yè)。由于其在工業(yè)上的巨大應(yīng)用潛力，促進(jìn)了大規(guī)模發(fā)酵工程、下游加工工程和對(duì)菌株的遺傳改造的發(fā)展，其結(jié)果有助于將絲狀真菌進(jìn)一步應(yīng)用于當(dāng)今的工業(yè)生產(chǎn)。大多數(shù)情況下，自然發(fā)生的菌株產(chǎn)生我們所需蛋白的水平很低，以至不能在商業(yè)上加以利用。因此，為了得到所需的目的蛋白，需對(duì)自發(fā)菌株進(jìn)行遺傳改造。隨著分子遺傳技術(shù)和真菌基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)的發(fā)展，利用基因工程方法對(duì)絲狀真菌進(jìn)行有目的的遺傳改造，已以成為可能。
絲狀真菌瑞氏木霉（Trichoderma reesei）是多細(xì)胞的真核微生物，其作為工業(yè)菌株用于生產(chǎn)分解不同植物材料的酶類，包括纖維素酶、半纖維素酶、蛋白酶、淀粉酶等，已有多年歷史。瑞氏木霉所產(chǎn)生的一種主要的纖維酶一纖維二糖水解酶I（cellobiohydrolase1），由單拷貝基因編碼，其產(chǎn)量可達(dá)瑞氏木霉胞外分泌性蛋白總量的50%[1]。由此可見，cbh1啟動(dòng)子是很強(qiáng)的啟動(dòng)子。因此在對(duì)瑞氏木霉的遺傳改造中，常利用cbh1的啟動(dòng)子與終止子序列構(gòu)建載體，并利用cbh1的前導(dǎo)肽序列引導(dǎo)重組蛋白進(jìn)行分泌性表達(dá)。瑞氏木霉具有極好的合成蛋白和分泌蛋白的能力；并具有真核的分泌機(jī)制，很可能還具有與哺乳動(dòng)物系統(tǒng)相似的蛋白修飾性能，如：高甘露糖型和N-糖基化[2]等。由于瑞氏木霉具有以上優(yōu)良性能，再加之其工業(yè)化規(guī)模發(fā)酵條件已比較成熟，這些都促進(jìn)了對(duì)瑞氏木霉的遺傳改造，為同源或異源分泌性蛋白的產(chǎn)生提供了一條行之有效的途徑。
瑞氏木霉不僅具有適于蛋白生產(chǎn)的諸多優(yōu)點(diǎn)，且對(duì)人沒(méi)有毒性，在產(chǎn)酶條件下也不產(chǎn)生真菌毒素和抗生素。近年來(lái)的實(shí)踐表明，經(jīng)過(guò)基因工程手術(shù)改造的瑞氏木霉重組菌株是安全無(wú)害的[3]。
2 過(guò)量生產(chǎn)同源蛋白一纖維素酶與木聚糖酶的生產(chǎn)
纖維素酶廣泛用于淀粉加工、谷物酒精發(fā)酵、麥芽制備和釀造、動(dòng)物飼養(yǎng)以及青貯飲料加工、果汁和蔬菜汁的提取等諸多方面，近年來(lái)被應(yīng)用于紡織、造紙、制漿等工業(yè)。由于纖維素酶應(yīng)用范圍極其廣泛，使得開發(fā)和改造纖維素酶生產(chǎn)菌株具有極強(qiáng)的現(xiàn)實(shí)意義。瑞氏木霉具有降解纖維素的完全酶系，所分泌的纖維素酶混合物通常包括內(nèi)切葡聚糖酶等多種酶活力。
1990年，Harkki等報(bào)道，通過(guò)基因定位置換整合使編碼CBHI的基因失活，結(jié)果EGI的產(chǎn)量提高，不再產(chǎn)生CBHI[4]（見圖1）。1993年，Karhunen等報(bào)道，將編碼EGI的基因置于強(qiáng)啟動(dòng)子cbh1的控制之下，用此表達(dá)盒替換染色體的cbh1位點(diǎn)之后，EGI的產(chǎn)量是通常強(qiáng)纖維素分解菌所得CBHI量的2倍或者與其一樣多[5]。其他人也曾報(bào)道過(guò)類似的情況。瑞氏木霉的一個(gè)或幾個(gè)纖維素酶基因經(jīng)基因位定位置換整合而失活[6，7]。這些菌株提供了一系列令人感興趣的新酶混合物，即可用于工業(yè)生產(chǎn)，又可用于研究不同酶組分對(duì)各種纖維底物的分解作用。
但是，基因失活和基因置換的方法，可能不適用于需極高特異和必須去除非必需酶活力的酶制劑。這是因?yàn)橛糜诿干a(chǎn)的培養(yǎng)基，可能會(huì)誘導(dǎo)產(chǎn)生大量其它水解酶類。而要使編碼這些酶的基因都失活，在實(shí)際當(dāng)中幾乎是不可能的。為了防止這類問(wèn)題的產(chǎn)生，Goldman(1992)、Schindler（1993）Nakari(1995)等人先后報(bào)道從瑞氏木霉中分離了非纖維素酶基因的啟動(dòng)子，包括pgk啟動(dòng)子、pkiA啟動(dòng)子、tefl啟動(dòng)子和一個(gè)在葡萄糖培養(yǎng)基上強(qiáng)表達(dá)但未知的cDNA1的啟動(dòng)子，這些啟動(dòng)子可以在葡萄糖培養(yǎng)基上啟動(dòng)合成所需要的纖維素酶，產(chǎn)生的酶制劑基本上沒(méi)有其它纖維素酶活力。在cDNA1啟動(dòng)子控制下所合成的纖維二糖水解酶和內(nèi)切葡聚酶產(chǎn)量最高可達(dá)50-100mg/L，占分泌蛋白總量50%以上[8]。1996年，Kurzatkowski等構(gòu)建了能在葡萄糖培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的瑞氏木霉的重組菌株，其攜帶的木霉糖酶Ⅰ或木霉糖酶Ⅱ結(jié)構(gòu)基因是在內(nèi)源丙酮酸激酶基因（pkil）表達(dá)信號(hào)的控制之下表達(dá)。通過(guò)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳和免疫染色，發(fā)現(xiàn)這兩種類型的轉(zhuǎn)化體在葡萄糖培養(yǎng)基上生長(zhǎng)時(shí)，能分別分泌出木霉糖酶Ⅰ和木霉糖酶Ⅱ。對(duì)于木霉糖酶來(lái)說(shuō)，最好的轉(zhuǎn)化體產(chǎn)生的特異性酶活力為76U/mg；而對(duì)于木霉糖酶Ⅱ來(lái)說(shuō)，則為145U/mg；都大大高出于自發(fā)菌株所產(chǎn)生的26U/mg[9]。
3 異源蛋白的生產(chǎn)
3.1真菌酶蛋白類
將Trichoderma harzianum P1染色體上的內(nèi)切幾丁質(zhì)酶基因分離，導(dǎo)入絲狀真菌瑞氏木霉，并在cbh1啟動(dòng)子過(guò)量表達(dá)。出發(fā)菌株瑞氏木霉RutC-30不具有任何內(nèi)切幾丁質(zhì)酶活力。T·harzianum內(nèi)切幾丁質(zhì)酶基因編碼區(qū)前的區(qū)段的瑞氏木霉中能正確發(fā)揮功能。搖瓶培養(yǎng)產(chǎn)生130mg/L有活力的幾丁質(zhì)酶，比T·harzianum產(chǎn)生的內(nèi)切幾丁質(zhì)酶活力提高大約20倍。瑞氏木霉RutC-30似乎能忍受內(nèi)切幾丁質(zhì)酶具有抗植物病原真菌的活力[10]，已被用于植物病源真菌的生物防治。另?yè)?jù)B.Cubero等（1997）報(bào)道，在瑞氏木霉組成型啟動(dòng)子ki和cbh2終止子的控制之下構(gòu)建了兩種載體，分別含有T·harzianum的基因chit33和bgn16.2的開放閱讀框（chit33編碼一種內(nèi)切幾丁質(zhì)酶，bgn16.2編碼一種外切葡萄糖淀粉酶），并獲得了穩(wěn)定的拷貝轉(zhuǎn)化體。對(duì)轉(zhuǎn)化體bng16.2來(lái)說(shuō)，整合到基因組中的基因拷貝數(shù)與mRNA和蛋白質(zhì)的積累量和在葡萄糖阻遏或幾丁質(zhì)酶誘導(dǎo)條件下的胞外牧特性酶活力之間均呈正相關(guān)。該菌株比野生型菌株能更迅速地抑制病原真菌的生長(zhǎng)。對(duì)轉(zhuǎn)化體chit33來(lái)說(shuō)，在葡萄糖阻遏的條件下。對(duì)轉(zhuǎn)化體chit33來(lái)說(shuō)，在葡萄糖阻遏的條件下，其產(chǎn)生的胞外幾丁質(zhì)酶活力是野生菌株的10倍[11]。
Joutsjoki VV(1994)報(bào)道，構(gòu)建了兩種一步基因置換載體。一種載體含有Hormoconis resinae葡萄糖淀粉酶P的基因組基因（gamP），另一種含有相應(yīng)的cDNA，都在瑞氏木霉cbh1啟動(dòng)子控制下表達(dá)。這些載體經(jīng)轉(zhuǎn)化后置換瑞氏木霉的cbh1基因。在這兩種載體中，cbh1啟動(dòng)子都能精確地連接到gamP蛋白質(zhì)編碼區(qū)上游，指導(dǎo)瑞氏木霉分泌出有活力的葡萄糖淀粉酶P（GAMP）。這表明gamP基因中內(nèi)含子序列在瑞氏木霉中得到了正確的加工。研究結(jié)果表明，含有g(shù)amP cDNA的最優(yōu)轉(zhuǎn)化體能分泌大約700mg/L有活力的GAMP，是在H.resinae中產(chǎn)量的20倍[12]，但chb1基因被gamP基因組基因置換的瑞氏木霉轉(zhuǎn)化體，所分泌的有活性的GAMP要多于含有3拷貝cDNA的轉(zhuǎn)化體。對(duì)瑞氏木霉分泌H.nisresinae葡萄糖淀粉酶P的研究結(jié)果表明，自然狀態(tài)未成熟GAMP的N端延伸部分可以在瑞氏木霉中作為一種有效的分泌信號(hào)，所產(chǎn)生的胞外葡萄糖淀粉酶活力高于以CBHI信號(hào)肽作為分泌信號(hào)時(shí)的情況[13]。
酵母基因在瑞氏木霉中表達(dá)的一例是：釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）DPM1基因（編碼甘露糖基磷酸多萜醇合成酶）的編碼區(qū)插入到pLMRS3質(zhì)粒中，在瑞氏木霉pki啟動(dòng)子和cbh2終止子控制下表達(dá)。在pFG1質(zhì)粒（含有瑞氏木霉pyr4基因）存在下，與pLMRS3質(zhì)粒一起對(duì)瑞氏木霉的一種pyr4陰性突變株TU-6進(jìn)行共轉(zhuǎn)化。然后篩選pyr4陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，得到4株多拷貝DPM1基因串聯(lián)整合的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化子。與受體菌株TU-6相比，轉(zhuǎn)化子的甘露糖基磷酸多萜醇合成酶活力提高了15-19倍，分泌的蛋白總量也提高了4倍[14]。
除以上蛋白外，被表達(dá)的真菌蛋白還包括肌醇六磷酸酶等。這些酶都是在cbh1啟動(dòng)子下表達(dá)，搖瓶培養(yǎng)產(chǎn)量達(dá)100mg/L水平。發(fā)酵培養(yǎng)中，產(chǎn)量為每升幾克。在cbh1啟動(dòng)子的控制之下，來(lái)自擔(dān)子菌綱的真菌Phlebia radiate的氧化還原酶（如：漆酶）的產(chǎn)量也達(dá)到中等水平
3.2哺乳動(dòng)物蛋白
瑞氏木霉已被用于牛凝乳蛋白酶的生產(chǎn)。利用cbh1啟動(dòng)子和終止子，通過(guò)共轉(zhuǎn)化外源基因與來(lái)自構(gòu)巢曲霉（Asp.nidulans）的amdS基因一起引入乙酰胺非利用型菌株。測(cè)量到的凝乳酶mRNA和分泌出的凝乳酶的量要比相應(yīng)的cbh1 mRNA和CBHI的量低1-2個(gè)數(shù)量級(jí)。這表明牛凝乳蛋白酶在瑞氏木霉中的表達(dá)受到了轉(zhuǎn)錄限制。但是，所獲得的40mg/L的水平，與典型的在構(gòu)巢曲霉素中的2-10mg/L的最初水平相比，還是一個(gè)可喜的進(jìn)步[15，16]。
另外，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，利用其它絲狀真菌生產(chǎn)的幾種人體蛋白是：表皮生長(zhǎng)因子（hEGF），生產(chǎn)激素（hGH），白細(xì)胞介素6，組織血纖維蛋白溶酶原激活因子（htPA）等。
Fab分子是由抗體完整的輕鏈和重鏈的Fd部分，由鏈間二硫鏈連接在一起。這種分子曾由木霉成功地生產(chǎn)出來(lái)，并用于研究其分泌過(guò)程。利用cbh1啟動(dòng)子和信號(hào)序列，分別構(gòu)建了表達(dá)輕鏈和重鏈的表達(dá)盒。首先構(gòu)建的是只產(chǎn)生輕鏈的菌株，然后用2種不同的重鏈表達(dá)載體進(jìn)行再轉(zhuǎn)化。這兩種載體分別指導(dǎo)Fd鏈或者與CBHI核心-連接區(qū)融合在Fd鏈的表達(dá)。只產(chǎn)生輕鏈的菌株分泌的輕鏈水平很低（0.2mg/L）。對(duì)前一種重鏈載體的轉(zhuǎn)化體來(lái)說(shuō)，在搖瓶培養(yǎng)中，分泌的有可能的Fab分子為1mg/L。在具有cbh1-Fd融合結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)化體菌株中，觀察到產(chǎn)量有顯著增長(zhǎng)。最優(yōu)菌株能分泌40mg/L具有免疫活力的CHBI-Fab融合蛋白。在發(fā)酵培養(yǎng)中，水平增長(zhǎng)到150mg/L.然而，沒(méi)有融合到CBHI上的Fab分子，水平仍為1mg/L。有趣的是，一種未知的木霉蛋白酶在CBHI-Fab融合蛋白的N-端特異去除2個(gè)氨基酸，能產(chǎn)生少量的Fab分子。釋放的Fab分子表現(xiàn)出免疫活性和對(duì)抗原的親和性，而CBHI-Fab分子的免疫活性要低5-12倍。對(duì)分離到的抗體鏈進(jìn)行定量測(cè)定表明，分泌出的所有輕鏈都和重鏈組裝在一起。CBHI-Fab產(chǎn)物的上清液中，含有顯著數(shù)量（800mg/L）的CBHI核心-連接區(qū)肽，它們來(lái)自CBHI-Fd融合分子。這樣，CBHI-Fd的產(chǎn)生是非常有效的（大于800mg/L），但其中只有少量（40mg/L）裝配成有功能的CBHI-Fab分子（或者，釋放的Fab分子）。這表明輕鏈的產(chǎn)生可能是限制性因素[17，18]。
4 總結(jié)
絲狀真菌瑞氏木霉已被成功地用于生產(chǎn)同源和異源蛋白。利用基因工程構(gòu)建具新生狀的菌株，在蛋白類物質(zhì)的生產(chǎn)方面已取得重要進(jìn)展。其中，在提高絲狀真菌異原蛋白產(chǎn)量的過(guò)程中，基因融合的方法特別值得注意。典型作法是，將編碼有目的蛋白的基因融合到自然情況下分泌性良好的內(nèi)源蛋白基因如葡萄糖淀粉酶、纖維二糖水解酶基因的下游。這種方法已在由Asp.awamori分泌牛凝乳蛋白酶（Ward等，1990），Asp.nidulans分泌白細(xì)胞介素6的過(guò)程中，被證明有效的（Contreras等，1991）。有趣的是，當(dāng)外源蛋白整合到CBHI核心-連接區(qū)上時(shí)，產(chǎn)量能夠提高。在牛凝乳蛋白酶的例子中，產(chǎn)量提高3-5倍；就抗體片段而言，產(chǎn)量提高50多倍（Nyysonen等地993）。
由上可見，在瑞氏木霉中已發(fā)現(xiàn)出多種分子系統(tǒng)，采用不同的策略用于同源和異源蛋白的生產(chǎn)。為了提高產(chǎn)量，使用強(qiáng)表達(dá)和有效分泌纖維素酶CBHI基因的不同部分，已被證明是一種有效的方法。雖然在基因組的分區(qū)段也可獲得外源基因的有效表達(dá)，但cbh1啟動(dòng)子很強(qiáng)，而且cbh1位點(diǎn)對(duì)于表達(dá)似乎也有益。將外源蛋白融合到CBHI的核心-連接區(qū)，能夠恢復(fù)對(duì)高水平表達(dá)起重要作用的區(qū)段，如：翻譯起始位點(diǎn)、信號(hào)肽序列及其作用位點(diǎn)。通過(guò)基因工程和發(fā)醇培養(yǎng)生產(chǎn)同源和異源蛋白，需要進(jìn)一步地改進(jìn)。對(duì)于不同的培養(yǎng)條件，包括含葡萄糖的培養(yǎng)基，應(yīng)該發(fā)展出不同的生產(chǎn)策略，策略和技術(shù)的發(fā)展將會(huì)拓寬瑞氏木霉生產(chǎn)重組蛋白的范圍。由于瑞氏木霉在大規(guī)模生產(chǎn)條件中（高達(dá)360m2發(fā)酵液）的良好表現(xiàn)，所以它特別適于所需大量蛋白的生產(chǎn)[19]。遺憾的是，目前國(guó)內(nèi)在這方面的研究尚未見報(bào)導(dǎo)。山東大學(xué)微生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室正在開展對(duì)于瑞氏木霉的分子生物學(xué)研究，已克隆到瑞氏木霉進(jìn)行菌株改造，通過(guò)基因定位置換整合，破壞其木糖醇脫氫酶基因，從而構(gòu)建木糖醇生產(chǎn)菌。
隨著瑞氏木霉分子生物學(xué)研究的開展及基因工程的瑞氏木霉的應(yīng)用，使我們構(gòu)建多種具有良好商業(yè)潛力的菌株成為可能。我們相信利用木霉大量生產(chǎn)多種酶和藥用產(chǎn)品，將不斷被證明是行之有效的。
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Advane of Molecular Biology in the Production of Recombinant Proteins by Filamentous Fungus Trichoderma reesei
分子生物學(xué)進(jìn)展范文第4篇
關(guān)鍵詞：土壤微生物生態(tài)學(xué)；核酸探針雜交；梯度凝膠電泳；PCR
土壤中存在著極其豐富的微生物種類，它們?cè)谕寥郎鷳B(tài)系統(tǒng)中各自行使著獨(dú)特的功能。自1953年以來(lái)，分子生物學(xué)理論和技術(shù)取得了驚人的成就，許多分子生物學(xué)研究方法和理念被應(yīng)用到微生物生態(tài)學(xué)研究中，為微生物生態(tài)學(xué)研究領(lǐng)域注入了新的活力，極大地推動(dòng)了微生物分子生態(tài)學(xué)的發(fā)展。下面介紹近年主要的幾種研究方法：
一、標(biāo)記核酸探針雜交技術(shù)
1.基本原理
以核酸分子雜交技術(shù)為核心，利用探針?lè)治鯠NA序列及片段長(zhǎng)度多態(tài)性。探針是能與特定核苷酸序列發(fā)生特異性互補(bǔ)的已知核酸片段，它可以是長(zhǎng)探針（100～l000bp），可以是短核苷酸片段（10～50bp），也可以是從RNA制備DNA探針，斑點(diǎn)印跡和狹線印跡雜交等不同的方法。
2.應(yīng)用
科學(xué)家應(yīng)用核酸雜交方法研究了被燃油污染及不污染的土壤提取的細(xì)菌DNA，結(jié)果表明：被污染的土壤提取的細(xì)菌DNA中各種烴的降解基因的檢出率顯著高于不污染的樣品，且定量分析結(jié)果表明污染越嚴(yán)重，這種降解基因的含量越高，因而可以用該方法作為對(duì)土壤中燃油污染程度的評(píng)價(jià)。
3.原位熒光雜交技術(shù)
（1）基本原理。FISH是以熒光標(biāo)記取代同位素標(biāo)記的一種新的原位雜交方法。它檢測(cè)核苷酸序列是利用熒光標(biāo)記的探針在細(xì)胞內(nèi)與特異的互補(bǔ)核苷酸序列雜交，通過(guò)激發(fā)雜交探針的熒光來(lái)檢測(cè)信號(hào)。
（2）應(yīng)用及其優(yōu)缺點(diǎn)?？梢赃M(jìn)行樣品的原位雜交，應(yīng)用于環(huán)境定微生物種群鑒定、種群數(shù)量分析及其特異微生物跟蹤檢測(cè)，現(xiàn)已成為微生物分子生態(tài)學(xué)研究中的熱點(diǎn)技術(shù)，在土壤微生物分子生態(tài)學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。FISH技術(shù)的應(yīng)用受到環(huán)境樣品微生物的生理狀態(tài)的影響，芽孢、放線菌及休眠時(shí)期的細(xì)胞的細(xì)胞膜的通透性低，影響群落中部分種屬豐度的錯(cuò)誤估計(jì)。
二、基于PCR技術(shù)的研究方法
PCR是一種聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)，主要特點(diǎn)是短時(shí)間內(nèi)在實(shí)驗(yàn)室條件下人為地控制并特異擴(kuò)增目的基因或DN段，使研究的目的基因及其環(huán)境樣品中的微量微生物基因得到無(wú)限的擴(kuò)增，為這些基因和微量微生物種群的研究提供了保證。
1.PCR-RFLP方法
（1）原理。PCR-RFLP法是將PCR引物中的一條加以熒光標(biāo)記，其基本原理是用PCR擴(kuò)增目的DNA，擴(kuò)增產(chǎn)物再用特異性內(nèi)切酶消化切割成不同大小片段，直接在凝膠電泳上分辨。
（2）應(yīng)用。現(xiàn)在很多研究人員利用16SrRNA來(lái)研究土壤微生物的多樣性。該技術(shù)還可以用來(lái)監(jiān)測(cè)因環(huán)境改變而引起的微生物種群的變化。
2.PCR-SSCP方法
（1）原理。日本Orita等研究發(fā)現(xiàn)，單鏈DN段呈復(fù)雜的空間折疊構(gòu)象，這種立體結(jié)構(gòu)主要是由其內(nèi)部堿基配對(duì)等分子內(nèi)相互作用力來(lái)維持的。當(dāng)有一個(gè)堿基發(fā)生改變時(shí)，會(huì)或多或少地影響其空間構(gòu)象，使構(gòu)象發(fā)生改變?？臻g構(gòu)象有差異的單鏈DNA分子在聚丙烯酰胺凝膠中受排阻大小不同。因此，通過(guò)非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，可以非常敏銳地將構(gòu)象上有差異的分子分離開。
（2）應(yīng)用。Sabine Peters等人用該法研究群落的演替和菌種的多樣性，并同傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法比較指出PCR-SSCP方法避免了傳統(tǒng)培養(yǎng)的費(fèi)時(shí)費(fèi)力以及誤差大的干擾，適合對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)和演替的分析。
三、DNA擴(kuò)增片段梯度電泳檢測(cè)技術(shù)
1.變性梯度凝膠電泳
（1）基本原理。雙鏈DNA分子在一般的聚丙烯酰胺凝膠電泳時(shí)，其遷移行為決定于其分子大小和電荷。DGGE技術(shù)在一般的聚丙烯酰胺凝膠基礎(chǔ)上，加入了變性劑（尿素和甲酰胺）梯度，從而能夠把同樣長(zhǎng)度但序列不同的DN段區(qū)分開來(lái)。
（2）應(yīng)用。DGGE方法是應(yīng)用最早也是最常用的單堿基突變篩查方法之一，自從1993年DGGE被引入微生物學(xué)以來(lái)，該技術(shù)被廣泛地用作分子工具比較微生物群落的多樣性以及監(jiān)視種群動(dòng)態(tài)。PCR-DGGE用于分析華盛頓州東部4種土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性，結(jié)果表明：管理和農(nóng)學(xué)實(shí)踐對(duì)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響比年降水量更大。
2.溫度梯度凝膠電泳
（1）基本原理。溫度梯度凝膠電泳技術(shù)則是利用溫度梯度變性的原理，利用了不同分子在溫度改變下構(gòu)象的差別進(jìn)行分離。
分子生物學(xué)進(jìn)展范文第5篇
關(guān)鍵詞：藥學(xué)分子生物學(xué)；生物學(xué)技術(shù)；課堂教學(xué)；教學(xué)方法
藥學(xué)分子生物學(xué)是在藥學(xué)、遺傳學(xué)和生物化學(xué)等學(xué)科的基礎(chǔ)上發(fā)展融合形成的新學(xué)科；它是將分子生物學(xué)的新理論、新技術(shù)滲入藥學(xué)研究領(lǐng)域，從而使藥物學(xué)研究由化學(xué)、藥學(xué)的培養(yǎng)模式轉(zhuǎn)化成為生命科學(xué)、藥學(xué)和化學(xué)相結(jié)合的新藥模式；同時(shí)它還是當(dāng)代生物科學(xué)發(fā)展的引擎，是現(xiàn)代生物技術(shù)的基石。[1]近年來(lái)隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展，它的應(yīng)用領(lǐng)域也在不斷拓寬，它與醫(yī)學(xué)和藥學(xué)方面的交叉也越來(lái)越多，因此，分子生物學(xué)在今后已經(jīng)不再只是生物技術(shù)專業(yè)的必修課，它也成為藥學(xué)院學(xué)生的重要必修的基礎(chǔ)課之一。
分子生物學(xué)主要是從分子水平上闡述生命現(xiàn)象和本質(zhì)的科學(xué)，是現(xiàn)代生命科學(xué)的“共同語(yǔ)言”。分子生物學(xué)技術(shù)把研究技術(shù)提高到了基因分子水平，可應(yīng)用于遺傳性疾病的研究和病原體的檢測(cè)及腫瘤的病因?qū)W、發(fā)病學(xué)、診斷和治療，新藥開發(fā)等方面的研究。所以，常用分子生物學(xué)技術(shù)是現(xiàn)代分子生物學(xué)研究的重要核心內(nèi)容之一。掌握了常用分子生物學(xué)技術(shù)，并能將理論和實(shí)際操作結(jié)合，也就相當(dāng)于掌握了一把從微觀世界揭示生物學(xué)奧秘的鑰匙。經(jīng)過(guò)多年教學(xué)，筆者將對(duì)此章節(jié)的教學(xué)體會(huì)總結(jié)如下。
一、介紹本學(xué)科最新前沿動(dòng)態(tài)，提高學(xué)生興趣
分子生物學(xué)是一門發(fā)展快速的前沿學(xué)科，由其發(fā)展帶來(lái)的成果和研究進(jìn)展日新月異。由于教材跟不上分子生物學(xué)發(fā)展速度，在授課時(shí)我們及時(shí)將最新的分子生物學(xué)進(jìn)展補(bǔ)充到教學(xué)內(nèi)容之中。以基因敲除技術(shù)為例，教材主要介紹傳統(tǒng)第一代同源重組方法，這種方法是經(jīng)典基因敲除方法，但效率低（1 per 106 cells），實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)，可以說(shuō)基本被淘汰的方法。隨后又出現(xiàn)了鋅指核酸酶（ZFN）[2]、TALEN、CRISPR/Cas9等方法。尤其是2012年出現(xiàn)最新CRISPR/Cas9方法，以能夠?qū)崿F(xiàn)任意敲除、成功率高、打靶效率很高、脫靶率高、周期非?？斓葍?yōu)點(diǎn)著稱。這種方法構(gòu)建的基因突變動(dòng)物具有顯著高于傳統(tǒng)方法的生殖系轉(zhuǎn)移能力，是一種高效、快速、可靠的構(gòu)建敲除動(dòng)物模型的新方法，所以在動(dòng)物模型構(gòu)建的應(yīng)用前景將非常廣闊。
將這些最新的分子生物學(xué)科學(xué)進(jìn)展補(bǔ)充到教學(xué)內(nèi)容之中，一方面可以提高學(xué)生學(xué)習(xí)興趣，另一方面使學(xué)生了解本學(xué)科最近發(fā)展動(dòng)態(tài)，從動(dòng)態(tài)中學(xué)習(xí)，而非死記硬背書本內(nèi)容，有助于大學(xué)生的能力和素質(zhì)培養(yǎng)。
二、注重融會(huì)貫通，重點(diǎn)突出，便于學(xué)生掌握重難點(diǎn)
以分子雜交技術(shù)為例，該技術(shù)可分為核酸分子雜交、蛋白質(zhì)分子雜交、原位雜交、生物芯片等，所涉及的概念、原理、方法操作較多。如何將這些紛繁復(fù)雜的內(nèi)容在一次理論教學(xué)中完成，我們進(jìn)行了深入的思考和探索，在授課時(shí)注意淡化概念，注重聯(lián)系實(shí)際和實(shí)驗(yàn)操作，使學(xué)生對(duì)整體分子雜交技術(shù)有感性的、總體上的認(rèn)識(shí)，然后記憶各個(gè)方法概念、知識(shí)點(diǎn)，這樣使各個(gè)知識(shí)點(diǎn)不是孤立存在，而是統(tǒng)一形成網(wǎng)絡(luò)，使學(xué)生學(xué)到的不是一個(gè)個(gè)孤立的知識(shí)點(diǎn)。將分子雜交技術(shù)與前面學(xué)到的基因、復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯銜接緊密，介紹每種方法應(yīng)用及其臨床意義，在教學(xué)中注意融會(huì)貫通和啟發(fā)式教學(xué)。以核酸分子雜交為例，核酸分子雜交又可分為Southern印跡和Northern 印跡，通過(guò)啟發(fā)式教學(xué)方法，學(xué)生通過(guò)短暫的回憶和思考，使思維進(jìn)入到“基因復(fù)制和轉(zhuǎn)錄”的空間中，再介紹兩種方法的原理和應(yīng)用范圍，從而學(xué)生能很好理解Southern印跡主要應(yīng)用于DNA檢測(cè)，而Northern 印跡用于分析mRNA的轉(zhuǎn)錄或mRNA分子大小，此時(shí)再進(jìn)行講授每種方法的操作流程，突出重點(diǎn)，便于學(xué)生掌握重難點(diǎn)，會(huì)取得更好的效果。
三、應(yīng)用多媒體教學(xué)，對(duì)學(xué)生進(jìn)行啟發(fā)式教學(xué)
多媒體資源已經(jīng)廣泛應(yīng)用于教學(xué)中，它可以使課堂教學(xué)內(nèi)容生動(dòng)活潑、豐富多彩，并徹底改變傳統(tǒng)的教學(xué)模式和學(xué)生的認(rèn)知過(guò)程。俗話說(shuō)好鋼要用在刀刃上。多媒體在教學(xué)中的應(yīng)用也是同樣需要用在“刀刃上”，這樣才能發(fā)揮其關(guān)鍵的作用。教學(xué)的“刀刃上”是指教學(xué)中的重難點(diǎn)以及銜接點(diǎn)、導(dǎo)入點(diǎn)、啟發(fā)點(diǎn)、思維盲點(diǎn)等，所以只有處理好這些關(guān)鍵點(diǎn)，才能上好這門課程。筆者通過(guò)網(wǎng)上查閱資料、Flash 動(dòng)畫和自制彩色圖片等方式，使復(fù)雜的分子生物學(xué)操作流程變得形象直觀、易記憶和理解，初步取得了較好的教學(xué)效果。每節(jié)課程結(jié)束前還進(jìn)行小結(jié)，將重難點(diǎn)內(nèi)容和圖片回放，并提出思考題讓學(xué)生思考，這樣既有助于理解和掌握本節(jié)課的內(nèi)容，又可排除學(xué)生對(duì)新知識(shí)的畏難和對(duì)學(xué)習(xí)的抵觸情緒，逐步養(yǎng)成起學(xué)生對(duì)分子生物學(xué)學(xué)習(xí)的興趣和信心。另外，每節(jié)課程結(jié)束后還進(jìn)行習(xí)題講解和課后答疑，利用QQ或郵件等手段與學(xué)生交流和互動(dòng)解答問(wèn)題，這樣可及時(shí)鞏固課堂知識(shí)和建立師生之間互信。因此，將多媒體應(yīng)用于教學(xué)中，可以使授課過(guò)程更加豐富多彩和靈活多樣，同時(shí)可使課堂教學(xué)更具有創(chuàng)新性。
四、將自身科研經(jīng)驗(yàn)運(yùn)用到教學(xué)中，讓教學(xué)內(nèi)容更豐富多彩
作為高校教師，我們?cè)诔袚?dān)教學(xué)任務(wù)的同時(shí)還從事一些科研工作，科研工作是將自己所學(xué)理論知識(shí)運(yùn)用于實(shí)踐。在教學(xué)過(guò)程中，為了豐富教學(xué)內(nèi)容，筆者將自己的科研成果和經(jīng)驗(yàn)穿插于教學(xué)中，這樣從實(shí)際出發(fā)可以使授課效果更生動(dòng)、具體和形象，讓學(xué)生更容易理解并加深印象。這種教學(xué)方式既可幫助學(xué)生更容易理解本課程內(nèi)容，并且還可將抽象的書本知識(shí)具體形象化，還開拓了學(xué)生的視野，激發(fā)學(xué)生學(xué)習(xí)興趣和動(dòng)力，使其不再認(rèn)為科學(xué)遙不可及。另外，利用課堂時(shí)間向?qū)W生介紹常用的科學(xué)文獻(xiàn)檢索方法和常用網(wǎng)址，讓學(xué)生在課余時(shí)間可以通過(guò)這些方式攝取相關(guān)知識(shí)，了解本學(xué)科最新研究動(dòng)態(tài)，擴(kuò)展視野，逐步培養(yǎng)學(xué)生自發(fā)地閱讀國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)，增強(qiáng)對(duì)科學(xué)研究的興趣，為以后研究生的學(xué)習(xí)打下基礎(chǔ)。
總之，針對(duì)常用分子生物學(xué)技術(shù)這章內(nèi)容在藥學(xué)分子生物學(xué)的重要性，以及其內(nèi)容的抽象性和復(fù)雜性的特點(diǎn)，我們通過(guò)不斷地實(shí)踐和探索，建立了高效的教學(xué)方法，并得到學(xué)生廣泛的好評(píng)。
參考文獻(xiàn)：
[1]蘇 嬌.藥學(xué)分子生物學(xué)教學(xué)語(yǔ)言藝術(shù)的探索[J].吉林醫(yī)學(xué)，2010，31（21）.
