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高效液相色譜范文第1篇

[關(guān)鍵詞] 高效液相色譜法；優(yōu)點(diǎn)；應(yīng)用；缺點(diǎn)；前景

[中圖分類號(hào)] R927[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A [文章編號(hào)]1673-7210（2008）08（a）-028-02

Generality of HPLC

ZHANG Jian-hong,CHEN You-sheng

(Department of Pharmacy, Guangdong Food and Drug Vocational College,Guangzhou 510520，China)

[Abstract] This paper summarizes the advantages, disadvantages, types, applications and foreground of HPLC

[Key words] HPLC; Advantage;Application;Disadvantage;Foreground

高效液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC)是利用高壓輸液泵驅(qū)使流動(dòng)相通過(guò)裝填固定相的色譜柱，按照固液相之間的分配機(jī)制對(duì)混合物進(jìn)行分離的方法。

1高效液相色譜法具有的優(yōu)點(diǎn)

與其他譜法相比具有以下優(yōu)點(diǎn)：①高分離率(應(yīng)用10 μm以下規(guī)則均勻的極細(xì)顆粒為固定相，所以傳質(zhì)阻抗小，柱效高,一般在1×103~5×105 n/m)；②高速(采用2×103~3×104 kPa的高壓輸液泵輸送液體流動(dòng)相，使其具有高流速,數(shù)分鐘至幾十分鐘可完成試樣分析)；③自動(dòng)化操作，重復(fù)性高；④高效相色譜柱可反復(fù)使用；⑤高靈敏度(廣泛使用了高靈敏檢測(cè)器,只需要試樣10-7~10-2 g)。

2高效液相色譜法分類

高效液相色譜法按照分離機(jī)制可分為以下4種：

2.1液-液分配色譜法（liquid-liquid chromatography)

LLC根據(jù)流動(dòng)相和固定相的極性不同又可分為，①正向LLC：流動(dòng)相極性固定相極性，極性大的組分先流出色譜柱，適合非極性物質(zhì)分離。

理論上應(yīng)不相溶的固定相和流動(dòng)相，實(shí)際上仍有少量微量固定相溶解，并且機(jī)械沖擊作用也會(huì)導(dǎo)致固定相流失，從而使柱的分離效率和選擇性降低, 目前主要采用化學(xué)鍵合固定相(即通過(guò)固定相的有機(jī)基團(tuán)與載體（硅膠）表面的游離羥基發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，從而使固定相與載體鍵合起來(lái))來(lái)克服這一問(wèn)題。

2.2液-固吸附色譜法（liquid-solid adsorption chromatogramphy）

在吸附色譜中，組分分子和流動(dòng)相分子對(duì)吸附劑（固定相）表面產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)性吸附，利用組分和固定相吸附力的不同而分離。

2.3離子交換色譜法(ion exchange chromatography)

離子交換劑上可解離的離子與流動(dòng)相中組分離子進(jìn)行可逆的離子交換，利用試樣中不同組分與離子交換劑具有不同的親和力而將它們分離的方法。

2.4空間排阻色譜法（凝膠色譜法）

試樣中分子量大小不同的組分進(jìn)入凝膠柱時(shí)，組分分子滲入微孔的程度不同，大分子直接從間隙中越過(guò)，首先出柱，分子越小，進(jìn)入微孔越深，保留值越大，溶劑分子通常最小，最后流出。主要用來(lái)分離高分子化合物，如蛋白質(zhì)、多糖等。

3高效液相色譜法的應(yīng)用

HPLC已成為應(yīng)用最為廣泛和有效的分離分析手段，應(yīng)用非常廣泛，目前，HPLC在醫(yī)藥、生化、天然產(chǎn)物主要成分的分析、食品分析、環(huán)境分析等方面都有廣泛的用途：

3.1醫(yī)藥方面

廣泛用于藥物的分離、分析、定量等[1-3]。

3.1.1藥物合成的分離精制在藥物合成反應(yīng)中，作為人工合成藥物的精制手段，用于除去少量雜質(zhì)，特別是那些異構(gòu)體的分離。值得提出的是，藥物中R-型和S-型的光學(xué)異構(gòu)體具有不同的生理作用。為了研究藥物的作用機(jī)制，需要拆分光學(xué)異構(gòu)體(即對(duì)映體)，這是很困難的工作，而高效液相色譜在這方面顯示了獨(dú)特的長(zhǎng)處。利用不同類型的手性固定相與對(duì)映體能生成穩(wěn)定性不同的非對(duì)映異構(gòu)體，從而達(dá)到分離目的。

3.1.2天然產(chǎn)物的分離分析天然產(chǎn)物的組分非常復(fù)雜，例如中草藥等，用高效液相色譜法進(jìn)行分離分析，具有簡(jiǎn)單快速的特點(diǎn)。

3.2在生命科學(xué)中的應(yīng)用[4,5]

其在生化領(lǐng)域的應(yīng)用主要集中于兩個(gè)方面：①低分子量物質(zhì)，如氨基酸、有機(jī)酸、有機(jī)胺、類固醇等的分離和測(cè)定。②高分子量物質(zhì)，如多肽、核糖核酸、蛋白質(zhì)和酶（各種胰島素、激素、細(xì)胞色素、干擾素等）的純化、分離和測(cè)定。 過(guò)去對(duì)這些生物大分子的分離主要依賴于等速電泳、經(jīng)典離子交換色譜等技術(shù)，但都有一定的局限性，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足生物化學(xué)研究的需要。因?yàn)樵谏I(lǐng)域中經(jīng)常要求從復(fù)雜的混合物基質(zhì)，如培養(yǎng)基、發(fā)酵液、體液、組織中對(duì)感興趣的物質(zhì)進(jìn)行有效而又特異的分離，通常要求檢測(cè)限達(dá)ng級(jí)或pg級(jí)，或pmol，fmol，并要求重復(fù)性好、快速、自動(dòng)檢測(cè)；制備分離、回收率高且不失活。在這些方面，HPLC具有明顯的優(yōu)勢(shì)。

3.3食品方面[6-8]

高效液相色譜法已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于下面二個(gè)領(lǐng)域：①食品營(yíng)養(yǎng)成分分析：蛋白質(zhì)、氨基酸、糖類、色素、維生素、香料、有機(jī)酸（鄰苯二甲酸、檸檬酸、蘋(píng)果酸等）、有機(jī)胺、礦物質(zhì)等；②食品添加劑分析：甜味劑、防腐劑、著色劑（合成色素如檸檬黃、莧菜紅、靛藍(lán)、胭脂紅、日落黃、亮藍(lán)等）、抗氧化劑等；③食品污染物分析：霉菌毒素（黃曲霉毒素、黃桿菌毒素、大腸桿菌毒素等）、微量元素、多環(huán)芳烴等。

3.4環(huán)境分析方面[9]

在對(duì)大氣中污染物的成分分析，廢水、廢汽和汽車尾氣中有害組分的分析中，高效液相色譜法發(fā)揮著很大的作用。

3.5農(nóng)業(yè)方面[10]

在農(nóng)業(yè)的發(fā)展中，高效液相色譜也發(fā)揮著很大的作用。它主要用來(lái)對(duì)各種農(nóng)作物中營(yíng)養(yǎng)成分進(jìn)行分析，特別是對(duì)多糖、脂肪酸、蛋白質(zhì)等分析都是極為有效的方法。

4 高效液相色譜法存在的問(wèn)題

4.1渦流擴(kuò)散（Eddy diffusion）

流動(dòng)相碰到較大的固體顆粒，就像流水碰到石頭一樣產(chǎn)生渦流。如果柱裝填得不均勻，有的部分松散或有細(xì)溝，則流動(dòng)相的速度就快；有的部位結(jié)塊或裝直緊密則流速就慢，多條流路有快有慢，就使區(qū)帶變寬。因此，固相載體的顆粒要小而均勻，裝柱要松緊均一，這樣渦流擴(kuò)散小，柱效率高。

4.2分子擴(kuò)散（Molecular diffusion）

分子擴(kuò)散就是物質(zhì)分子由濃度高的區(qū)域向濃度低的區(qū)域運(yùn)動(dòng)，也稱縱向分子擴(kuò)散。要減少分子擴(kuò)散就要采用小而均勻的固相顆粒裝柱。同時(shí)在操作時(shí)，如果流速太慢，被分離物質(zhì)停留時(shí)間長(zhǎng)，則擴(kuò)散嚴(yán)重。

4.3質(zhì)量轉(zhuǎn)移（Mass transfer）

被分離物質(zhì)要在流動(dòng)相與固定相中平衡，這樣才能形成較窄的區(qū)帶。在液相色譜中，溶質(zhì)分子要在兩個(gè)液相之間進(jìn)行分配，或在固相上被吸附和解吸附均需要一定的時(shí)間。當(dāng)流速快時(shí)，轉(zhuǎn)移速度慢，來(lái)不及達(dá)到平衡流動(dòng)相就向前移，產(chǎn)生物質(zhì)的非平衡移動(dòng)，使區(qū)帶變寬。

4.4流動(dòng)相流速

當(dāng)流速太低時(shí)，分子擴(kuò)散嚴(yán)重。如將理論塔板高度對(duì)流速作圖，理論塔板高度隨流速增加而急速下降，當(dāng)達(dá)到最低值時(shí)，流速再加大則質(zhì)量轉(zhuǎn)移起主要作用，理論塔板高度又加大。在高效液相色譜中，流速稍快影響不大，但在凝膠過(guò)濾色譜中，因?yàn)槲镔|(zhì)要滲透到凝膠內(nèi)部，所以質(zhì)量轉(zhuǎn)移影響大，流速加大會(huì)降低柱效率。

4.5固定相顆粒大小

固定相顆粒越小柱效率越高，對(duì)流動(dòng)相流動(dòng)的阻力越大，需要加大壓力才能使它流動(dòng)。

5展望

高效液相色譜法雖存在上述不足之處，但由于分析速度快、分離效率高、檢測(cè)靈敏度高、檢測(cè)自動(dòng)化、適用范圍廣、組分易回收、樣品處理較簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，從而在醫(yī)藥、食品、生化、環(huán)境分析等領(lǐng)域還是有著廣泛的應(yīng)用前景。

[參考文獻(xiàn)]

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高效液相色譜范文第2篇

【摘要】

目的采用高效液相色譜（HPLC）法測(cè)定不同白芍藥材中芍藥苷含量，確定哪種白芍含芍藥苷最高。方法采用色譜柱：Hypersil C18柱（4.6 mm×200 mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.05%磷酸水（14：86）；檢測(cè)：UV 230 nm；流速：1.0 ml/min；柱溫：25℃。結(jié)果2年生、10月份采收貯存期短的亳州白芍芍藥苷含量最高。結(jié)論該方法簡(jiǎn)便準(zhǔn)確可靠、重復(fù)性好。

【關(guān)鍵詞】 白芍 芍藥苷 高效液相色譜 質(zhì)量

Abstract:ObjectiveTo compare the quality of different Radix Raeoniae Alba with HPLC methods. MethodsThe separation was carried out on Hypersil C18 column（4.6 mm×200 mm，5μm）； the mobile phase was acetonitrile-H2O (acidified to 0.05% with phosphoric acid)（14∶86）；the flow-rate was 1.0mml/min； the column temperature was 25℃. ResultsThere was the highest content of paeoniflorin in Radix Paeoniae Alba of two -year-growing time harvested in October with short storage time.ConclusionThe method is simple， rapid with good reproducibility.

Key words:Radix Paeoniae Alba； Paeontflorin； HPLC； Quality

白芍為毛茛科植物芍藥Paeonia lactiflora Pall的干燥根，其主要成分為芍藥苷（Paeoniflorin）、芍藥內(nèi)脂苷（Albiflorin）、氧化芍藥苷（Oxypaeoniflorin）、苯甲酰芍藥苷（Benzoylpaeoniflorin），通稱芍藥總苷（total glucosides of paeony， TGP）。具有抗炎、抗病毒、解痙鎮(zhèn)痛、護(hù)肝等多種藥理活性。白芍藥材及各種制劑均以芍藥苷含量為質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

高效液相色譜儀（四元泵、柱溫箱、MVD檢測(cè)器、Agilent1100 色譜工作站）、電子分析天平AE240 （十萬(wàn)分之一，瑞士，METTLER-TOLEDO Co.）、CQ250超聲波清洗器（上海超聲波儀器廠）、UV-3300（日本日立公司）。

1.2 試藥

芍藥苷對(duì)照品（編號(hào)：0900-200102，含量測(cè)定用，中國(guó)藥品生物制品檢定所購(gòu)），白芍藥材經(jīng)江西中醫(yī)學(xué)院藥用植物學(xué)科組鑒定符合2000年版《中國(guó)藥典》白芍項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)。乙腈為色譜純（Merk Co.），水為雙蒸水，其它試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液制備

精密稱取白芍對(duì)照品適量，加50%乙醇制成每毫升含60 mg的溶液，搖勻，即得。

2.2 供試品溶液的制備

精密稱取本品干燥的粉末0.5 g，置50 ml容量瓶中，精密加入50%乙醇35 ml，超聲提取30 min，冷卻，加50%乙醇至刻度，搖勻，濾過(guò)，再過(guò)0.45 μm濾膜，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.3 色譜條件

色譜柱： Hypersil C18柱（4.6 mm×200 mm，5 μm）（大連Elite公司）；流動(dòng)相：乙腈-0.05%磷酸水（14∶86）；檢測(cè)：UV 230 nm；流速：1.0 ml/min；柱溫：25℃。理論塔板數(shù)以芍藥苷峰計(jì)算不得低于2 000。在上述色譜條件下，取對(duì)照品溶液、供試品溶液各進(jìn)樣10 μl進(jìn)行HPLC測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖1～2。由圖中可見(jiàn)供試品中芍藥苷與芍藥苷對(duì)照品峰保留時(shí)間一致，并且與樣品中其它組分達(dá)到了很好的分離。

2.4 線性關(guān)系

考察精密稱取芍藥苷對(duì)照品0.024 80 g，置50 ml容量瓶中，加稀乙醇稀釋至刻度，即得到2.48 mg/ml的芍藥苷對(duì)照品溶液，從中分別精密吸取0.25，0.5，2.5，5.0，10.0和15.0 ml的對(duì)照品溶液，分別置6個(gè)25 ml的容量瓶中，用稀乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得對(duì)照品溶液。分別精密吸取上述對(duì)照品溶液各10 μl，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程Y=1 809.398 4X+2.213 5，r=0.999 99。

2.5 提取方法的確定

本實(shí)驗(yàn)對(duì)提取溶劑、提取溶劑的濃度、提取時(shí)間、提取方法等進(jìn)行綜合考察，最后確定供試品溶液的制備方法為：用50%乙醇超聲提取30 min即可。

2.6 精密度實(shí)驗(yàn)

精密吸取同一份供試品溶液10 μl，重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定芍藥苷峰面積積分值，RSD為0.80%。

2.7 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)

按“供試品溶液的制備”方法，對(duì)同一批樣品分別制備6份供試品溶液，各吸取10 μl進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得芍藥苷含量RSD為0.72%。

2.8 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取同一份供試品溶液在上述色譜條件下，分別在0，6，12，24，36，72 h各進(jìn)樣10 μl，測(cè)定芍藥苷峰面積積分值RSD為0.64%。

2.9 回收率實(shí)驗(yàn)

采用加樣回收測(cè)定法。分別精密稱取已知含量（芍藥苷1.778%）的樣品約0.25 g，共6份，分別加入一定量的對(duì)照品（濃度為0. 88 mg/ml，精密加入5 ml），按“供試品溶液的制備”方法制備供試品溶液，進(jìn)行HPLC測(cè)定，測(cè)得芍藥苷的平均回收率為99.92%，RSD為1.36%；結(jié)果見(jiàn)表1。結(jié)果表明，本法回收率高。表1 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果（略）

2.10 樣品含量測(cè)定

精密吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液各10 μl進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表2。表2 13批樣品的芍藥苷含量測(cè)定結(jié)果（略）

3 討論

3.1 不同產(chǎn)地芍藥苷含量差異 從芍藥苷含量測(cè)定結(jié)果看，不同產(chǎn)地的白芍芍藥苷含量各不相同。其主要成分芍藥苷含量以亳州產(chǎn)白芍最高；本實(shí)驗(yàn)所用亳州白芍為帶皮的根，與文獻(xiàn)［1］報(bào)道的未去皮白芍藥材中芍藥苷含量最高相符。

3.2 不同采收期芍藥苷量差異從芍藥苷含量測(cè)定結(jié)果看，以四川白芍為例，采收期8月份，9月份，10月份芍藥苷含量不同，采收期在10月份芍藥苷含量最高，與文獻(xiàn)［2］報(bào)道的采收期在10月份芍藥苷含量最高相符。

3.3 貯存期對(duì)芍藥苷含量的影響從白芍飲片1（貯存1年）、白芍飲片3（貯存2年）、白芍飲片4（貯存3年）芍藥苷含量測(cè)定結(jié)果看，隨貯存期的延長(zhǎng)，白芍中芍藥苷的含量呈下降趨勢(shì)，所以白芍的貯存期不宜太長(zhǎng)。

3.4 不同生長(zhǎng)年限對(duì)芍藥苷含量的影響不同生長(zhǎng)期亳州白芍中芍藥苷的含量不同，以2年生者含量最高，隨著生長(zhǎng)期的延長(zhǎng)，芍藥苷的含量呈下降趨勢(shì)。據(jù)有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道可能因?yàn)樯L(zhǎng)期長(zhǎng)，淀粉含量增加，芍藥苷在體內(nèi)轉(zhuǎn)化分解。這提示合理利用亳州白芍資源，可縮短生長(zhǎng)期，增加芍藥苷含量，即經(jīng)濟(jì)又有效。

總之，根據(jù)上述測(cè)定結(jié)果，可見(jiàn)本法操作簡(jiǎn)單，重現(xiàn)性好，可作為白芍質(zhì)量控制的有效方法。

參考文獻(xiàn)

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高效液相色譜范文第3篇

【關(guān)鍵詞】 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜; 玩具; 致癌染料; 致敏染料

simultaneous determination of 16 carcinogenic and allergenous　dyestuffs in toys by ultra performance liquid chromatography　tandem mass spectrometryma qiang，bai hua*，wang chao，zhang qing，ma wei，zhou xin，dong yi-yang，wang bao-lin(chinese academy of inspection and quarantine，beijing 100123)(china agriculture university，beijing 100083)(dongning entry-exist inspection and quarantine bureau，dongning 157200)abstract a comprehensive analytical method based on ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry has been developed for the simultaneous determination of 16 carcinogenic and allergenous dyestuffs(acid red 26，basic red 9，disperse blue 1，acid violet 49，disperse blue 3，solvent yellow 1，dispersed blue 106，disperse orange 3，disperse yellow 3，basic violet 1，basic violet 3，disperse red 1，solvent yellow 3，disperse blue 124，solvent yellow 2 and disperse orange 37).various toy samples，including textile，leather，paper，wood，balloon，modeling clay，limitation tattoo and aqueous liquid，were extracted under ultrasonication.qualitative and quantitative analysis was carried out for the analyte under the mrm mode after the chromatographic separation on waters acquity uplc beh c18(50 mm × 2.1 mm，1.7 μm) column.the limits of quantitation(loq) for the 16 dyestuffs were in the range of 1.0－8.0 μg/kg.the mean recoveries at the three spiked levels of 5－100 μg/kg were 81.3%－98.6%，with the intra-day precision less than 11% and the inter-day precision less than 14%.the method is accurate，rapid，sensitive，and adapt to the inspection of the 16 dyestuffs in toys.

keywords ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry; toys; carcinogenic dyestuffs; allergenous dyestuffs

1 引言

我國(guó)是玩具產(chǎn)品的生產(chǎn)和消費(fèi)大國(guó)，也是國(guó)際玩具產(chǎn)品的主要出口國(guó)。Www.133229.CoM玩具材料中含有的有毒有害化學(xué)物質(zhì)可通過(guò)吞咽、舔食、皮膚接觸、眼睛接觸、吸入等方式進(jìn)入體內(nèi)，從而對(duì)兒童的健康安全造成嚴(yán)重危害， 玩具的安全性一直是社會(huì)關(guān)注的熱點(diǎn)問(wèn)題〖1〗。在染色過(guò)程中，染料分子通過(guò)吸附、擴(kuò)散等多種化學(xué)或物理處理，從染液轉(zhuǎn)移到被染物上而使之染色〖2〗。目前，已經(jīng)證實(shí)存在多種可誘發(fā)人體癌變或引起人體皮膚、黏膜或呼吸道過(guò)敏的致癌和致敏染料〖3〗。鑒于致癌和致敏染料的嚴(yán)重危害，許多國(guó)家和世界權(quán)威組織相繼頒布了嚴(yán)格的法規(guī)和技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行限制。按照歐洲標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)制訂的en 71玩具安全系列標(biāo)準(zhǔn)對(duì)玩具化學(xué)性能的要求，酸性紅26、堿性紅9、分散藍(lán)1、酸性紫49、分散藍(lán)3、溶劑黃1、分散藍(lán)106、分散橙3、分散黃3、堿性紫1、堿性紫3、分散紅1、溶劑黃3、分散藍(lán)124、溶劑黃2、分散橙37等16種致癌和致敏染料在玩具產(chǎn)品中不得檢出〖4〗9噬鬧繁曜糘eko-tex standard 1000〖5〗、歐盟2002/371/ec指令〖6〗、我國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《生態(tài)紡織品技術(shù)要求》〖7〗、環(huán)境保護(hù)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《環(huán)境標(biāo)志產(chǎn)品技術(shù)要求 生態(tài)紡織品》〖8〗也分別將酸性紅26等染料列為致癌和致敏染料。

目前，檢測(cè)致癌和致敏染料的方法主要有高效液相色譜法〖9~12〗、離子對(duì)色譜法〖13〗、液相色譜-質(zhì)譜法〖10，11〗和氣相色譜-質(zhì)譜法〖14〗等，但這些方法的靈敏度、選擇性和分析通量還存在不足。超高效液相色譜技術(shù)與傳統(tǒng)的液相色譜技術(shù)相比，大幅度改善了液相色譜的分析速度、分離效率、樣品通量和靈敏度。超高效液相色譜與串聯(lián)四極桿質(zhì)譜聯(lián)用，能夠充分發(fā)揮超高效液相色譜的高速、高分離度與串聯(lián)質(zhì)譜的高選擇性、高靈敏度的優(yōu)勢(shì)，采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)掃描方式可提供特征的母離子及其子離子信息，為目標(biāo)化合物的定性與定量分析提供了可靠依據(jù)。本研究建立了同時(shí)測(cè)定玩具中16種致癌和致敏染料的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析方法，在9 min內(nèi)完成了16種染料多組分的快速分離檢測(cè)，為玩具樣品的高通量快速檢測(cè)提供了可靠的分析平臺(tái)，可應(yīng)用于玩具的實(shí)際檢驗(yàn)工作和產(chǎn)品質(zhì)量控制。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

acquity超高效液相色譜儀、quattro micro api三重四極桿質(zhì)譜儀、masslynx數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)（美國(guó)waters公司）；milli-q超純水器（美國(guó)millipore公司）； kq-600b型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）； ms2型漩渦振蕩器（德國(guó)ika公司）； n-1000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（日本eyela公司），配有bc-55型真空冷卻系統(tǒng)（日本yamato公司）； acrodisc ghp雙性濾膜（美國(guó)pall公司）； 乙腈、甲醇、無(wú)水乙醇（hplc級(jí)，美國(guó)fisher公司）； 乙酸銨（hplc級(jí)，美國(guó)acros公司）； 實(shí)驗(yàn)用水為經(jīng)milli-q凈化系統(tǒng)（0.22 μm過(guò)濾膜）過(guò)濾的去離子水； 氮?dú)?、氬氣?gt;99.999%）； 其它試劑均為分析純。

酸性紅26（純度84%）、堿性紅9（純度95%）、酸性紫49（純度96%）、分散藍(lán)3（純度20%）、堿性紫1（純度30%）、堿性紫3（純度80%）、分散藍(lán)124（純度70%）和溶劑黃2（純度95%）購(gòu)自德國(guó)dr.ehrenstorfer公司；分散藍(lán)1（純度30%）、溶劑黃1（純度99%）、分散藍(lán)106（純度95%）、分散黃3（純度30%）、分散紅1（純度95%）、和分散橙37（純度95%）購(gòu)自美國(guó)sigma公司；分散橙3 (純度95%)和溶劑黃3 (純度99%)購(gòu)自美國(guó)acros公司，16種染料的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均為市場(chǎng)上最高純度標(biāo)準(zhǔn)樣品，它們的化學(xué)文摘號(hào)、染料索引號(hào)等參數(shù)見(jiàn)附表1（/table/090704.pdf）。

2.2 色譜條件

waters acquity uplc beh c18柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相：乙腈（a）和5 mmol/l乙酸銨溶液，ph=5.0（b），梯度洗脫程序：0~2.0 min，28%~40% a；2.0~6.0 min，40% a；6.0~9.0 min，40%~95% a；9.0~9.5 min，95% a；9.5~10.0 min，95%~28% a。流速0.3 ml/min；柱溫30 ℃；樣品室溫度20 ℃；進(jìn)樣量5 μl。

2.3 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源；正離子掃描；毛細(xì)管電壓4.0 kv；射頻透鏡電壓0.1 v；離子源溫度120 ℃；去溶劑氣溫度350 ℃；去溶劑氣流量600 l/h；錐孔氣流量50 l/h；光電倍增器電壓650 v；碰撞氣體為氬氣，碰撞氣壓0.32 pa； 多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（mrm）模式檢測(cè)，16種染料的質(zhì)譜分析參數(shù)見(jiàn)表1， mrm色譜圖見(jiàn)圖1。

表1 16種致癌和致敏染料的質(zhì)譜分析參數(shù)（略）

table 1 ms parameters for 16 carcinogenic and allergenous dyestuffs analysis

圖1 16種致癌和致敏染料的mrm色譜圖（略）

fig.1 mrm chromatograms of 16 carcinogenic and allergenous dyestuffs

色譜峰編號(hào)同表1（the peak numbers are the same as in table 1）.

2.4 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液和工作液的配制

準(zhǔn)確稱取適量的各染料標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解并定容至100 ml，配制成1000 mg/l標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于－20 ℃下保存。準(zhǔn)確量取各染料標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液5 ml，用甲醇定容至100 ml，配制成50 mg/l混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。使用時(shí)，用甲醇逐級(jí)稀釋成混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，于4 ℃下保存，現(xiàn)用現(xiàn)配。

2.5 樣品處理

2.5.1 紡織品、皮革、紙張、木材、氣球、造型黏土、貼紙材質(zhì)玩具材料的處理 取代表性樣品，測(cè)試試樣應(yīng)從單個(gè)樣品上的可觸及部分移取，同種材料可合并作為同一測(cè)試試樣，將其剪碎至3 mm×3 mm以下，混勻。準(zhǔn)確稱取1.0 g試樣置于50 ml具塞錐形瓶中，準(zhǔn)確加入15 ml無(wú)水乙醇，超聲提取15 min。將提取液轉(zhuǎn)移至50 ml雞心瓶中，殘?jiān)偌尤?5 ml無(wú)水乙醇提取一次。合并提取液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀于40 ℃水浴減壓濃縮至近干，用氮?dú)饩徛蹈珊?，?zhǔn)確加入1 ml甲醇溶解殘?jiān)?，過(guò)0.20 μm微孔濾膜后，供uplc/ms/ms測(cè)定。

2.5.2 可接觸液體玩具材料的處理 取代表性樣品，測(cè)試試樣應(yīng)從單個(gè)樣品上的可觸及部分移取，同種材料可合并作為同一測(cè)試試樣。準(zhǔn)確稱取1.0 g試樣置于50 ml具塞錐形瓶中，準(zhǔn)確加入15 ml無(wú)水乙醇，超聲提取15 min，將提取液轉(zhuǎn)移至50 ml雞心瓶中，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀于40 ℃水浴減壓濃縮至近干，用氮?dú)饩徛蹈珊?，?zhǔn)確加入1 ml甲醇溶解殘?jiān)?，過(guò)0.20 μm微孔濾膜后，供uplc/ms/ms測(cè)定。

3 結(jié)果與討論

3.1 樣品處理方法的優(yōu)化

酸性紅26等16種染料的正辛醇/水分配系數(shù)（kow）介于－0.83~4.58之間，極性范圍分布較寬，各染料均在無(wú)水乙醇中有較好的溶解性。因此，選擇無(wú)水乙醇為提取溶劑。為了減少操作步驟及獲得盡可能高的提取率，采用超聲提取方式對(duì)樣品進(jìn)行提取。考察了不同提取時(shí)間（10， 15， 20和25 min）和提取次數(shù)（1， 2和3次）的提取效果，確定了最佳的樣品處理?xiàng)l件。

3.2 色譜條件的優(yōu)化

3.2.1 色譜柱的選擇 采用亞微米小顆粒填料色譜柱可獲得更高的分離度、樣品通量和靈敏度。分別考察了具有不同選擇性的uplc色譜柱（規(guī)格均為50 mm×2.1 mm，1.7 μm）對(duì)16種染料的分離效果：c18及c8（直鏈烷烴）、shield rp18（內(nèi)嵌有氨基甲酸酯極性基團(tuán)）、phenyl（苯基連接在c6直鏈的硅甲基官能團(tuán)上）、hilic（硅膠基質(zhì)）、hss t3（三鍵c18烷基鍵合）。結(jié)果表明，16種染料在acquity uplc beh c18色譜柱上獲得了最為理想的分離效果。

3.2.2 流動(dòng)相的選擇 分別考察了反相色譜常用的有機(jī)相溶劑（甲醇和乙腈）與不同種類和ph值的揮發(fā)性緩沖液組成的流動(dòng)相體系，如甲醇（或乙腈）-5 mmol/l甲酸銨溶液（ph值分別調(diào)節(jié)為3.75， 4.00， 4.25， 4.50， 4.75， 5.00， 5.25， 5.50和5.75）、甲醇（或乙腈）-5 mmol/l乙酸銨（ph值分別調(diào)節(jié)為2.75， 3.00， 3.25， 3.50， 3.75， 4.00， 4.25， 4.50和4.75）、甲醇（或乙腈）-0.1%甲酸溶液等對(duì)染料化合物的色譜行為和離子化程度的影響。結(jié)果表明，以乙腈-5 mmol/l乙酸銨溶液（ph=5.0）作為流動(dòng)相時(shí)獲得了最優(yōu)的色譜峰形、分離效果和質(zhì)譜信號(hào)響應(yīng)。進(jìn)一步比較了乙酸銨緩沖液離子強(qiáng)度的影響，乙酸銨溶液濃度從2 mmol/l變化到10 mmol/l的結(jié)果表明，5 mmol/l乙酸銨為最佳添加量。由于上述16種染料包括酸性染料、堿性染料、分散染料、直接染料等類別，化學(xué)結(jié)構(gòu)上涵蓋了偶氮型、三芳甲烷型、蒽醌型、雜環(huán)型等，各染料的化學(xué)性質(zhì)和保留性質(zhì)相差較大，選擇梯度洗脫方式，通過(guò)優(yōu)化流動(dòng)相梯度洗脫條件實(shí)現(xiàn)了16種染料的有效分離。

3.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

在esi+和esi－離子化模式下，分別進(jìn)行全掃描以選擇適當(dāng)?shù)碾婋x方式和準(zhǔn)分子離子峰。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，大部分染料在離子源esi+電離方式下，可獲得較高豐度的〖m + h〗+母離子。酸性紅26、酸性紫49等含鈉染料的母離子為〖(m－nna)+(n+1)h〗+，堿性紅9、堿性紫1、堿性紫3等含氯染料的母離子為〖m－cl+h〗+，16種染料的二級(jí)質(zhì)譜圖見(jiàn)附圖1（/fig/090704.pdf）。在確定各染料的母離子后，采用子離子掃描方式進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析，對(duì)子離子進(jìn)行了優(yōu)化選擇，確定定量離子和輔助定性離子，通過(guò)優(yōu)化毛細(xì)管電壓、一級(jí)錐孔電壓、二級(jí)錐孔電壓、射頻透鏡電壓、碰撞能量、質(zhì)譜分辨率等質(zhì)譜參數(shù)，使每種染料的準(zhǔn)分子離子與特征碎片離子產(chǎn)生的離子對(duì)強(qiáng)度達(dá)到最大。

3.4 uplc/ms/ms與hplc/ms/ms的比較

本研究組曾建立了同時(shí)測(cè)定玩具中酸性紅26等16種致癌和致敏染料的hplc/ms/ms方法，其完成一次樣品分析的時(shí)間為27 min， 流動(dòng)相消耗量為27 ml（流速為1.0 ml/min）。而本方法在9 min之內(nèi)即完成了對(duì)16種染料的分析測(cè)定，分析時(shí)間為hplc/ms/ms方法的1/3，顯著提高了樣品分析通量，完成一次樣品分析的溶劑消耗量?jī)H為2.7 ml，為hplc/ms/ms方法的1/10，提高了分析速度，降低了分析成本，減少了廢液產(chǎn)生。

3.5 線性范圍和檢出限

分別配制一系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，在選定的色譜條件和質(zhì)譜條件下進(jìn)行測(cè)定，16種染料的線性方程、線性范圍和相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表2。以信噪比為10估算定量限（loq），16種染料的定量限為1.0~8.0 μg/kg。

表2 16種致癌和致敏染料的線性方程、線性范圍和相關(guān)系數(shù)（n=3）（略）

table 2 linear equations，linear ranges and correlation coefficients of 16 carcinogenic and allergenous dyestuffs(n=3)

3.6 方法的回收率和精密度

分別稱取經(jīng)測(cè)定不含有16種染料的紡織品、皮革、紙張、木材、可接觸液體、氣球、造型黏土、貼紙等材質(zhì)的玩具樣品1.0 g，分別添加不同濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)添加濃度6個(gè)平行樣，進(jìn)行添加回收率和精密度實(shí)驗(yàn)，用超高效液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜進(jìn)樣測(cè)定。在低、中、高的3個(gè)添加水平范圍內(nèi)的平均回收率為81.3%～98.6%。16種染料中代表性物質(zhì)的回收率和精密度結(jié)果見(jiàn)表3，全部結(jié)果見(jiàn)附表2（/table/090704.pdf）。在一日內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)和不同日期（5 d內(nèi)）測(cè)定的日內(nèi)精密度均小于11%； 日間精密度均小于14%。

3.7 樣品測(cè)定

應(yīng)用本方法對(duì)布絨、皮革、紙制、木制、泥制等不同類型的玩具樣品共25件進(jìn)行了分析測(cè)定，均未檢出含有致癌和致敏染料。

表3 玩具（紡織品、皮革、紙張）中16種致癌和致敏染料的部分添加回收率結(jié)果（n=6）（略）

table 3 results of recovery for 16 carcinogenic and allergenous dyestuffs in textile，leather and paper samples(n=6)

【參考文獻(xiàn)】

1 department of supervision on inspection，general administration of quality supervision，inspection and quarantine of the people’s republic of china(國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局檢驗(yàn)監(jiān)管司).toy safety testing and regulation(玩具安全測(cè)試及法規(guī)).beijing(北京)：china standard press(中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社)，2007： 170

2 chen shi-neng(陳士能).encyclopedia of chinese chemical products(中國(guó)化工產(chǎn)品大全.中卷).beijing(北京)：chemical industry press(化學(xué)工業(yè)出版社)，1998： 859

3 he jin-xin(何瑾馨).the chemistry of dyes(染料化學(xué)).beijing(北京)：china textile & apparel press(中國(guó)紡織出版社)，2009： 11

4 safety of toys-part 9：organic chemical compounds-requirement. en 71-9-2005

5 ko-tex standard 1000，ko-tex international，ausgabe/edition 01/2009

6 commission decision of 15 may 2002 establishing the ecological criteria for the award of the community eco-label to textile products and amending decision 1999/178/ec(2002/371/ec)

高效液相色譜范文第4篇

關(guān)鍵字 HPLC；藥物；分析

中圖分類號(hào)R9 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A 文章編號(hào) 1674-6708（2014）112-0182-02

高效液相色譜法是20世紀(jì)60年代末70年代初發(fā)展起來(lái)的一種快速、高效的新型分離分析技術(shù)。，并且可以直接用于分析難揮發(fā)、熱不穩(wěn)定及高分子樣品，彌補(bǔ)了氣相色譜法的弱點(diǎn)，擴(kuò)大了色譜法的應(yīng)用范圍，高效液相色譜法包括吸附色譜法、分配色譜法、離子交換色譜法和分子排阻色譜法，其中基于分配機(jī)理的高效液相色譜法在藥品檢驗(yàn)中應(yīng)用非常廣泛的一種儀器分析方法。

1離子色譜法在藥物分析中的應(yīng)用

離子色譜法是美國(guó) Small等人在離子交換色譜法的基礎(chǔ)上建立起來(lái)的一種離子分離分析液相色譜技術(shù)，以其靈敏、快速、精密度高、抗干擾能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，主要應(yīng)用于藥物及合成中間體的分析、復(fù)雜組分中的某一組分鑒定、藥物離子的價(jià)態(tài)及形態(tài)分析等方面。

晏菊姣等建立了離子色譜法測(cè)定注射用頭孢他啶中碳酸鈉的含量，鈉離子濃度在2mg/L~20mg/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系（r=0.9992），平均回收率為100.6% （n=9），測(cè)得定量限為0.002mg/L，該方法采用 Ionpac CG12A，CS12A陽(yáng)離子交換柱，淋洗液為18mmoL/L 甲烷磺酸，CSRS-ULTRA 4mm自動(dòng)抑制循環(huán)模式，抑制電流為60mA。

張偉等采用高效陰離子交換色譜法測(cè)定人凝血因子Ⅷ中枸櫞酸離子的含量，采用 IonPac AS11-HC離子交換柱（4mm×250mm），流動(dòng)相為20mmol/L的 NaOH 溶液，等度洗脫 20min，采用 ASRS 4mm陰離子抑制器，電導(dǎo)檢測(cè)器，測(cè)得枸櫞酸離子濃度在 0.1～2.0μg/mL范圍內(nèi)，對(duì)照品色譜峰面積與枸櫞酸離子濃度呈良好的線性關(guān)系，r=0.9990，總平均回收率 97.80%，RSD為0.69%，該方法的檢測(cè)限為 0.01μg/mL，彌補(bǔ)了《中國(guó)藥典》三部（2010版）中規(guī)定方法的不足之處。

2反相高效色譜法在藥物分析中的應(yīng)用

反相高效色譜法是指流動(dòng)相極性大于固定相極性的分配色譜法，適用于分離非極性至中等極性的各類分子型物質(zhì)，應(yīng)用范圍也比正相色譜法更廣泛。

陳德志等建立同時(shí)測(cè)定咪達(dá)唑侖、硝西泮、地西泮3種藥物血藥濃度的反相高效液相色譜法，色譜柱為 Symmetry shield RP18 柱（250mm×4.6mm，5.0μm），流動(dòng)相為甲醇 - 磷酸鹽緩沖液（55:45，v/v，pH2.15），咪達(dá)唑侖、硝西泮、地西泮質(zhì)量濃度在 20-4000ng/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系（r≥0.9996，n=5），回收率98.2%～103.9%之間。

翁水旺等建立反相高效液相色譜法分離測(cè)定奧美拉唑腸溶膠囊的含量及有關(guān)物質(zhì)的方法，采用 VARIAN C18（4.6mm×250mm，5μm）色譜柱，以甲醇 - 水 - 三乙胺 - 磷酸（67:33:0.3:0.12）為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為302nm，測(cè)得奧美拉唑在濃度4.0μg/ml~40.0μg/ml范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系，r=0.99999，平均回收率為100.3%，RSD為 0.17%。

鐘延霞等建立了反相高效液相色譜法測(cè)定吉非替尼的方法，采用Hypersil BDS C18-5μm（250mm×4.6mm）色譜柱，流動(dòng)相為乙腈-0.15%三氟乙酸（體積比為2∶8），紫外檢測(cè)波長(zhǎng)254nm，吉非替尼的質(zhì)量為6.824 0μg~34.1200μg時(shí)線性關(guān)系良好，線性系數(shù)為0.99908，加標(biāo)回收率大于95%，檢測(cè)底限為20.7248μg。

趙軍等建立了反相高效液相色譜法同時(shí)分離測(cè)定6種臨床最常用的頭孢菌素(頭孢他啶、頭孢拉定、頭孢氨芐、頭孢哌酮、頭孢唑林、頭孢噻肟)，采用SHIM-PACK VP-ODS色譜柱，以乙腈及0.05mol/L HAC-NaAC緩沖溶液（pH=4.0）組成流動(dòng)相梯度淋洗，在15min內(nèi)分離并測(cè)定了上述 6 種頭孢菌素，6種藥物最低檢出限均可達(dá)到 0.20μg/mL。

3 超高效液相色譜在藥物分析中的應(yīng)用

超高效液相色譜系指一種采用小顆粒填料色譜柱（粒徑小于2 μm）和超高壓系統(tǒng)（壓力大于105 kPa）的新型液相色譜技術(shù)，能顯著改善色譜峰的分離度和檢測(cè)靈敏度，同時(shí)大大縮短分析周期，其較大的峰容量和更高的靈敏度更適于中藥中多成分的分析。

唐軍等建立了一種快速測(cè)定血栓通注射液中5種皂苷成分（三七皂苷R1及人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd）含量的方法，應(yīng)用新型的超高效液相色譜系統(tǒng)，使用1.7μm填料的BEH C18色譜柱（50mm×2.1mm），乙腈-水兩相溶劑梯度洗脫，5種皂苷成分在測(cè)定的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，r＞0.9984，RSD小于3.1%，最低定量限和最低檢測(cè)限可分別達(dá)到0.5ng和0.2ng，平均回收率均大于95.0%。

4 高效液相色譜聯(lián)用在藥物分析中的應(yīng)用

胡曉玲等建立超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC-MS）測(cè)定健康人血漿中阿托伐他汀濃度，阿托伐他汀濃度在0.385ng/mL~15.400ng/mL線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)達(dá)0.9974，日內(nèi)、日間RSD符合方法學(xué)要求。

陳吉漢等建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-MS）測(cè)定雞肉與雞蛋中 6種他汀類藥物殘留量。色譜柱為BEH C18，以甲醇-0.1% 甲酸 5mmol 乙酸銨為流動(dòng)相，梯度洗脫分離，6 種他汀類藥物在 1.0～100μg/kg濃度范圍內(nèi)線性良好，r＞0.9910，檢出限和定量限分別為 0.1～0.5μg/kg和0.3μg/kg~2.0μg/kg。

王映紅等應(yīng)用高效液相-核磁共振聯(lián)用技術(shù)（LC-NMR）對(duì)微量級(jí)蛇葡萄根提取物中混合物的各個(gè)組分進(jìn)行分離，并獲得1H NMR及COSY譜，通過(guò)與此類化合物所建立的氫譜數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比較分析，確定了微克級(jí)的天然產(chǎn)物混合物中的主要組分的化學(xué)結(jié)構(gòu)及立體結(jié)構(gòu)，使微量天然混合物中的主要組分的化學(xué)結(jié)構(gòu)及立體結(jié)構(gòu)得到證實(shí)，充分體現(xiàn)了LC-NMR技術(shù)的微量、快速的特點(diǎn)。

5 結(jié)論

高效液相色譜法選擇性高、靈敏度高、分析速度快，并可同時(shí)用于有關(guān)物質(zhì)檢查與含量測(cè)定的特點(diǎn)，成為醫(yī)藥研究的有力工具，在天然藥物及復(fù)方成藥分析，抗生素分析，手性藥物分析，臨床治療藥物檢測(cè)等領(lǐng)域均需用到HPLC的不同測(cè)定方法。

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高效液相色譜范文第5篇

[關(guān)鍵詞] 珍;含量測(cè)定;高效液相色譜

[中圖分類號(hào)]R927.2[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]B [文章編號(hào)]1674-4721(2009)07(a)-134-02

珍由珍珠、牛黃、三七、黃芩提取物、冰片、豬膽汁等組成,具有清熱解毒,消腫止痛的功效,主要用于咽喉腫痛,瘡瘍熱癤[1]。為了更好地控制其質(zhì)量,保證臨床用藥安全有效,本實(shí)驗(yàn)采用了HPLC法測(cè)定了制劑中人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1和三七皂苷R1的含量[2-5],方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、可靠。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

島津LC-2010高效液相色譜儀,Intersil C18柱(4.6 mm×150 mm,5 μm)。

1.2 試藥

人參皂苷Rg1對(duì)照品(Ⅰ)(供含量測(cè)定用,批號(hào):0703-9812)、人參皂苷Rb1對(duì)照品(Ⅱ)(供含量測(cè)定用,批號(hào):110704-200217)、三七皂苷R1對(duì)照品(Ⅲ)(供含量測(cè)定用,批號(hào):0745-200006)(中國(guó)藥品生物制品檢定所提供);珍(北京因科瑞斯生物制品研究所提供);乙腈為色譜純,水為高純水,其余試劑均為分析純。

2 定量分析

2.1 色譜條件

Intersil C18色譜柱(4.6 mm×150 mm,5 μm);流動(dòng)相乙腈(A)-水(B)梯度洗脫見(jiàn)表1,檢測(cè)波長(zhǎng)203 nm,流速1.5 ml/min,柱溫30 ℃,進(jìn)樣量10 μl,理論板數(shù)按Ⅲ峰計(jì)算應(yīng)不低于2 000。在該色譜條件下,樣品中被測(cè)成分能夠達(dá)到基線分離,保留時(shí)間在15 min內(nèi),陰性無(wú)干擾,色譜圖見(jiàn)圖1。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ對(duì)照品適量,加甲醇制成每1 ml含Ⅰ0.55 mg、Ⅱ0.45 mg和Ⅲ0.20 mg的混合溶液,即得。

2.3 供試品溶液的制備

取本品細(xì)粉適量(約1.5 g),精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入甲醇50 ml,稱定重量,加熱回流提取2 h,放冷,用甲醇補(bǔ)足減失的重量,濾過(guò),精密量取續(xù)濾液25 ml,蒸干,殘?jiān)?%氫氧化鈉50 ml,分次溶解并移入分液漏斗中,用水飽和的正丁醇振搖提取5次(分別為30,30,20,20,20 ml),合并正丁醇液,用正丁醇飽和的水洗滌至中性,每次25 ml,正丁醇液另器貯存,合并水液,用水飽和的正丁醇30 ml振搖提取,醇液與上述正丁醇液合并,蒸干,殘?jiān)右颐? ml洗滌,棄去乙醚液,殘?jiān)鼡]盡乙醚,加甲醇溶解,并移至10 ml量瓶中,用甲醇稀釋至刻度,搖勻,用微孔濾膜(0.45 μm)濾過(guò),取續(xù)濾液,即得。

2.4 陰性樣品溶液的制備

按珍處方,除去三七藥材,制備陰性對(duì)照樣品。按“供試品溶液的制備”項(xiàng)制備陰性樣品溶液。

2.5 線性關(guān)系考察

分別精密稱?、?、Ⅱ和Ⅲ對(duì)照品適量,加甲醇溶解并稀釋,制得濃度分別為1.144 mg/ml、0. 948 mg/ml和0.434 mg/ml的對(duì)照品溶液。分別精密吸取該溶液1、2、5、7、10 ml,置于10 ml的容量瓶中,加甲醇稀釋至刻度,搖勻,各進(jìn)樣10 μl,連續(xù)進(jìn)樣2次,按上述色譜條件測(cè)定峰面積。以對(duì)照品進(jìn)樣量(X)為橫坐標(biāo),色譜峰峰面積為縱坐標(biāo)(Y),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,回歸方程見(jiàn)表2。

2.6 精密度試驗(yàn)

取同一批供試品溶液,在上述色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣5次,各樣品峰面積的RSD分別為:Ⅰ1.38%,Ⅱ1.11%,Ⅲ1.96%,表明精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一批供試品溶液,在上述色譜條件下,分別于0,2,4,8,12,24 h測(cè)定,各樣品在24 h內(nèi)峰面積的RSD分別為:Ⅰ0.69%,Ⅱ1.00%,Ⅲ1.88%,表明樣品在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批樣品,按擬定的方法平行測(cè)定6份,平均含量為Ⅰ8.21 mg/g,Ⅱ7.21 mg/g,Ⅲ1.97 mg/g,RSD分別為:Ⅰ0.82%,Ⅱ1.82%,Ⅲ1.91%,表明該方法的重復(fù)性較好。

2.9 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取已知含量的樣品6份,各加入一定量的Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ,在上述色譜條件下測(cè)定,計(jì)算回收率,平均回收率分別為Ⅰ96.46%,Ⅱ98.17%,Ⅲ96.27%,RSD分別為:Ⅰ1.01%Ⅱ1.02%,Ⅲ1.06%

2.10 樣品測(cè)定

取五批樣品(批號(hào):20041019、20041122、20050303、20050601、20050605),分別按“供試品溶液的制備”項(xiàng)制備供試品溶液,準(zhǔn)確吸取供試液10 μl,在上述色譜條件下測(cè)定,總含量(mg/g)分別為5.11、5.14、5.14、5.11、5.16。

3 討論

3.1 流動(dòng)相的選擇

通過(guò)參考有關(guān)文獻(xiàn),測(cè)定三七中人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、三七皂苷R1的流動(dòng)相多為乙腈-水梯度洗脫。經(jīng)試驗(yàn),采用文中流動(dòng)相,對(duì)照品及供試品溶液中各色譜峰均能達(dá)到基線分離,效果良好。

3.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

取人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、三七皂苷R1對(duì)照品,加甲醇分別制成20、30、50 μg/ml的溶液,用紫外可見(jiàn)分光光度儀分別進(jìn)行200～400 nm波長(zhǎng)的掃描,可見(jiàn)人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、三七皂苷R1均在203 nm處有最大吸收峰,故選擇203 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

本文提出的 HPLC法能簡(jiǎn)便、靈敏、準(zhǔn)確地測(cè)定珍的含量,能滿足質(zhì)量控制需要。

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