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蛋白酶抑制劑范文第1篇

【關(guān)鍵詞】 Eppin； ； 男性； 不育癥； 避孕； 無癥

進入21世紀，人們逐漸發(fā)現(xiàn)人類的繁衍生育能力正在逐漸下降，不孕不育已成為繼心腦血管疾病、腫瘤之后威脅全人類生存的三大疾病之一。WHO指出，排除女方的因素，婚后有規(guī)律性生活、未采取任何避孕措施的夫妻生活達到一年以上者，女方仍未能懷孕，可診斷為男性不育癥。據(jù)WHO最新的統(tǒng)計結(jié)果顯示，全球的不孕不育患者占世界人口的15%，并且這個數(shù)字還在飛速增加。我國的發(fā)病率約在12.5%左右，這些患者中約40%是由于男性因素導(dǎo)致的[1]。

質(zhì)量是決定男性生育力最主要的方面，男性質(zhì)量的下降是導(dǎo)致男性不育癥的最重要原因，主要有少癥、弱癥以及畸形癥[2]；另一方面，現(xiàn)代社會女性意外懷孕后的流產(chǎn)比例越來越高，目前針對男性的避孕措施僅僅局限于、體外、輸精管結(jié)扎等[3]，并沒有針對男性的可逆性藥物，所以針對男性的避孕措施相對較少。大量研究表明Eppin（epididymal peptidase inhibitor）與生殖和免疫性避孕關(guān)系密切。本文對Eppin基因及蛋白的發(fā)現(xiàn)、特征及其在男性生殖等方面的作用做一綜述。

1Eppin的發(fā)現(xiàn)及特征

研究發(fā)現(xiàn)部分人的精漿中存在一種蛋白質(zhì)抗體，這種抗體會阻礙的液化和的運動，進而導(dǎo)致男性不育，后來人們將其命名為Eppin蛋白，由Eppin基因編碼[4-6]。

人類Eppin表達的三種mRNA實際上只編碼兩種蛋白亞型（1、3的蛋白質(zhì)序列一樣），分別為Eppin 1和Eppin 2，它們的區(qū)別在于N端的氨基酸序列不同。Eppin 1是最主要的，它的mRNA編碼133個氨基酸殘基，1～21是信號肽，22～133是成熟蛋白，所以是一種分泌蛋白；Eppin蛋白理論上的等電點是8.52，相對分子質(zhì)量（Mr）為15283[7]。這類蛋白質(zhì)在和附睪中被檢測到，可能在靈長類動物的繁衍中發(fā)揮重要的作用。

2Eppin對活動力的影響

O′Rand等[8，9]研究證實，重組Eppin免疫的雄猴無法使雌猴自然受孕，經(jīng)過檢測這些雄猴的血清發(fā)現(xiàn)其Eppin抗體陽性率非常高。王增軍等[10]采用嚴謹?shù)膶嶒灧椒ㄗC明了存在于精漿中和表面的Eppin蛋白能夠與精囊的凝固蛋白酶（Semenogelin）結(jié)合，同時讓重組Eppin和重組Semenogelin的不同氨基酸片段自由結(jié)合，發(fā)現(xiàn)C端Eppin75-133氨基酸片段能夠與Sg164-283氨基酸片段相結(jié)合，而且人類Semenogelin中唯一的胱氨酸殘基（Cys239）就存在于Semenogelin片段中，這項研究證實了Eppin能夠通過影響Semenogelin而發(fā)揮其作用，因此推測Eppin可能干擾了Eppin-Semenogelin結(jié)合，使形成團塊影響了活動力。

ELISA法檢測25例抗抗體陽性的不育患者中有7例Eppin（28%）陽性。然后使用Western blot方法進一步檢測7例陽性患者的標(biāo)本，發(fā)現(xiàn)有5例Eppin陽性表達。另外對25例可以正常生育的男性患者的進行檢測，發(fā)現(xiàn)抗Eppin抗體均為陰性表達。這說明抗抗體陽性的不育患者的中含有抗Eppin抗體?？笶ppin抗體能夠通過干擾正常Eppin和Semenogelin的相互作用，影響的成熟過程和液化情況，致使運動能力下降，進而導(dǎo)致患者不育。

丁新良等[11]通過對Eppin基因SNPS（單核苷酸多態(tài)性）的研究發(fā)現(xiàn)，位點rs2231829與數(shù)量之間以及位點rs6124715、rs11594與運動能力之間均存在顯著相關(guān)性。在SNPS與發(fā)病風(fēng)險的分析中，發(fā)現(xiàn)多態(tài)性位點rs2231829和rs11594的存在顯著改變男性原發(fā)性不育癥的發(fā)病風(fēng)險，并且這種風(fēng)險在質(zhì)量異常的病例中非常明顯。然而，這些SNPS各基因型對應(yīng)的血清睪酮水平?jīng)]有顯著性差異。生物信息學(xué)分析表明，位點rs2231829影響轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合，而位點rs11594影響mRNA結(jié)構(gòu)。因此可以推測Eppin基因多態(tài)性可能通過影響轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合以及mRNA的結(jié)構(gòu)而影響該基因的生物學(xué)功能，進而干擾成熟過程，影響生育結(jié)局，但是這一假設(shè)還有待進一步研究證實。此外，以小鼠為研究對象，采用整體動物RNA干擾結(jié)合顯微注射與膜片鉗技術(shù)，發(fā)現(xiàn)Eppin基因低表達會引起小鼠運動能力明顯下降，主要表現(xiàn)為平均路徑速度、活力、直線速度和曲線速度的顯著下降。進一步研究表明與運動能力變化相一致的是，小鼠生精細胞的T型鈣電流也隨之顯著下降，T型鈣通道的mRNA水平亦顯著降低。因此可以得出以下結(jié)論：Eppin基因低表達導(dǎo)致生精細胞T型鈣通道m(xù)RNA水平的降低和T型鈣電流的下降，進而引起運動能力的下降。

3Eppin在OA和NOA診斷中的應(yīng)用

基于Eppin基因在附睪和異性表達，Liu B等[18]采用Western blot的方法檢測40例正常人和46例無癥患者中Eppin蛋白的表達，將精漿中Eppin蛋白有表達的無癥患者診斷為非梗阻性無癥（NOA，Non obstructive azoospermia），而精漿中Eppin蛋白無表達的無癥患者診斷為梗阻性無癥（OA，Obstructive azoospermia），并且進一步通過經(jīng)皮附睪穿刺術(shù)/經(jīng)皮穿刺術(shù)（PESA/TESA）確診無癥的類別。對比發(fā)現(xiàn)，通過Western blot檢測Eppin蛋白的表達得到的診斷結(jié)果與PESA/TESA的診斷結(jié)果非常類似。因此，Eppin蛋白檢測或許是一種新的、有效的、無創(chuàng)的診斷OA和NOA的方法，將來有望在臨床中得到廣泛的應(yīng)用。

4Eppin在男性避孕方面的應(yīng)用

目前在避孕領(lǐng)域，男性避孕疫苗是研究的熱點之一。Eppin蛋白是由和附睪特異性分泌，廣泛存在于后的人類頭部和尾部表面，進入附睪輸出管后，表面與附睪頭部和尾部所分泌的Eppin蛋白會發(fā)生特異性結(jié)合；另一方面，膜蛋白在發(fā)生和成熟過程中、受精過程中和胚胎早期發(fā)育過程中有著至關(guān)重要的作用，可能涉及到獲能、頂體反應(yīng)、穿透卵子透明帶、精卵結(jié)合和受精卵的分裂等方面，機體可能對一些膜蛋白發(fā)生免疫反應(yīng)，導(dǎo)致免疫性不孕癥。頂體赤道區(qū)及頂體內(nèi)膜含有頂體膜蛋白17（Sp17），Sp17會在頂體反應(yīng)后大量表達，有促進受精的作用，其機制可能是Sp17能夠與透明帶上的糖基結(jié)合引起。因此Sp17和Eppin都可作為潛在的避孕疫苗靶點。

房磊臣等[19]采用基因重組及抗原抗體反應(yīng)等方法，將人Sp17和Eppin作為靶抗原，成功構(gòu)建了酵母Sp17-Eppin融合蛋白表達系統(tǒng)，獲得了高純度Sp17-Eppin融合蛋白，并且進一步在大量動物實驗中發(fā)現(xiàn)這種融合蛋白疫苗組的避孕效應(yīng)顯著強于單一重組的Sp17蛋白疫苗組，大大增加了避孕效應(yīng)。盡管其避孕效應(yīng)具有可逆性，但同時也會造成縮小，因此對的生精功能會有一定程度的影響。然而這仍是對融合蛋白避孕疫苗構(gòu)建的大膽嘗試，為探索開發(fā)安全、高效、可逆的男性免疫性避孕疫苗新途徑打下了堅實的實驗基礎(chǔ)。

5Eppin與糖尿病、肥胖癥的關(guān)系

糖尿病、肥胖癥等對男性生育力的影響正越來越受到大家的關(guān)注，它們造成的激素改變和新陳代謝紊亂會對男性生育力構(gòu)成一定的危害，而且現(xiàn)在糖尿病和肥胖癥的發(fā)病年齡越來越小，因此越來越多的人的生育力在生育年齡之前已經(jīng)受到負面的影響。最近一項研究表明體重指數(shù)（BMI）對男性生育力的影響僅次于年齡。采用差異凝膠電泳方法對糖尿病患者、肥胖人群和正常人群的Eppin蛋白質(zhì)組進行分析識別，對數(shù)據(jù)結(jié)果進行對比分析，證實了糖尿病患者和肥胖人群與正常人群之間的Eppin蛋白質(zhì)組在表達程度上存在顯著性差異[12～17]。

6結(jié)語

綜上所述，Eppin基因和蛋白對質(zhì)量有重要的影響，進而影響男性生育，但對其具體的分子機制報道的較少，下一步應(yīng)著重對其機制方面進行研究。中抗Eppin抗體的檢測或許能成為一種研究男性免疫性不育機制的無創(chuàng)的方法，不僅改善了不育癥患者的特異性診療，拓寬了患者的輔助診斷指標(biāo)，同時也為男性免疫性避孕疫苗的研發(fā)提供了一定的實驗和臨床研究基礎(chǔ)。

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蛋白酶抑制劑范文第2篇

【關(guān)鍵詞】 構(gòu)建； 原核表達； 水蛭源性類胰蛋白酶抑制劑

［Abstract］ Objective: To construct the prokaryotic expression vector of LDTI gene and express LDTI protein in E.coli［BL21(DE3)］.Methods： A 141 bp fragment of the LDTI gene was amplified by PCR technique from the template of the plasmid containing LDTI gene， then it was cloned into T vector.After amplified and digested with restricted enzyme， the target fragment was subcloned into plasmid pET28a， the recombinant plasmid was transferred into E.coli Jm109.The fragment was identified by restricted enzyme and nucleotide sequencing.The recombinant expression plasmid containing LDTI gene was transformed into E.coli BL21(DE3) and the target protein expression was induced by isopropylBDthiogalactopyranoside(IPTG) and confirmed by TricineSDSPAGE and Western blot. Results： The recombinant plasmid of pET28aLDTI was obtained by PCR and identified by sequencing.The target protein was expressed abundantly in E.coli BL21(DE3) and the yield of LDTI protein was accounted for approximately 15% of germ proteins after one hour′s induction by 0.7 mmol/L IPTG at 33℃. Conclusion： pET28aLDTI was successfully constructed and can highly express objective protein in BL21(DE3)， which will further help to the bioactivity of LDTI studying.

［Key words］ construction; prokaryotic expression; leech derived tryptase inhibitor

類胰蛋白酶抑制劑（tryptase inhibitor，TPI）屬于絲氨酸蛋白酶抑制劑家族，具有穩(wěn)定肥大細胞的作用［1］，對于肥大細胞介導(dǎo)的變態(tài)反應(yīng)性疾病如哮喘、變應(yīng)性鼻炎等有潛在的治療作用。類胰蛋白酶是肥大細胞分泌的最豐富的介質(zhì)之一，在多種疾病的進程中起到誘導(dǎo)作用［2］。類胰蛋白酶抑制劑通過抑制類胰蛋白酶活性來達到治療疾病的目的。研究證實［3］，水蛭源性類胰蛋白酶抑制劑與人β類胰蛋白酶具有高度親和力并以此抑制其活性。我們運用DNA重組技術(shù)，構(gòu)建了水蛭源性類胰蛋白酶抑制劑原核表達質(zhì)粒，通過雙酶切以及核酸序列分析進行分析鑒定后將其轉(zhuǎn)化入大腸埃希菌BL21（DE3）中，使其在原核系統(tǒng)中高效表達，為下一步分析LDTI蛋白的特性與功能奠定了良好的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 酶及主要試劑 DNA 標(biāo)準(zhǔn)參照物、Taq酶、T4連接酶、Hind Ⅲ和NdeⅠ購自TaKaRa公司，凝膠純化試劑盒，質(zhì)粒小量提取試劑盒購自Qiagen公司，TRICINE及低分子量蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品購自Sigma公司，蛋白質(zhì)印跡一抗為抗HIS Tag的鼠單克隆抗體（IgG1），購自Novagen公司。其他常用試劑為國產(chǎn)或進口分析純試劑。

1.1.2 菌種及質(zhì)粒 pMD18T載體購自日本TaKaRa公司，含有目的LDTI編碼序列的質(zhì)粒由大連TaKaRa公司合成。大腸埃希菌 JM109，BL21(DE3)及表達載體pET28a為本校張忠芳老師饋贈。

1.1.3 核酸序列分析 由上海英駿公司采用ABI377全自動測序儀器和配套的試劑盒測序。1.2 方 法

1.2.1 引物設(shè)計與合成 根據(jù)LDTI氨基酸序列推導(dǎo)出目的核酸序列并設(shè)計引物，由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。上游引物序列：5′GGCATATGAAAAAAGTTTGCGC3′；下游引物序列：5′TAAGCTTTTACGTCGGGCAGGA3′。其中，為了方便克隆操作，在上下游引物中加入了限制性內(nèi)切酶NdeⅠ，Hind Ⅲ的酶切位點，以便LDTI核酸片段定向克隆于相應(yīng)的酶切位點上，保證閱讀框架的正確性和完整性。此外在限制性內(nèi)切酶Hind Ⅲ，NdeⅠ酶切位點引入1至2個保護性堿基，以利于酶切反應(yīng)進行。

1.2.2 LDTI片段擴增 PCR反應(yīng)體系為：DNA 0.3 μl，Taq酶2 U，10×緩沖液2 μl，dNTP 1.6 μl和引物0.4 μl，加DDW至總體積20 μl。 PCR擴增條件：預(yù)變性94℃ 2 min，94℃ 1 min 62℃ 1 min 72℃ 1 min，25個循環(huán)，反應(yīng)結(jié)束前72℃延伸10 min。

1.2.3 構(gòu)建T載體克隆 按照凝膠純化試劑盒操作流程純化PCR產(chǎn)物后與T載體連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸埃希菌JM109，經(jīng)過藍白斑篩選，挑選單個陽性克隆，在100 μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中過夜生長，提取質(zhì)粒，進行雙酶切和測序鑒定。

1.2.4 構(gòu)建原核表達載體亞克隆 將T載體克隆雙酶切后目的片段及pET28a雙酶切后片段經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，回收，按照凝膠純化試劑盒操作流程純化PCR產(chǎn)物，將純化后的兩核酸片段16℃連接，過夜。轉(zhuǎn)化感受態(tài)細菌JM109，挑取陽性克隆，接種于含100 μg/ml卡那霉素的LB培養(yǎng)基中過夜生長，按照質(zhì)粒小量抽提試劑盒說明書提取質(zhì)粒，進行雙酶切和測序鑒定。

1.2.5 LDTI蛋白的誘導(dǎo)表達 將重組質(zhì)粒pET28aLDTI轉(zhuǎn)化BL21(DE3)，挑取單個菌落，接種于3 ml含100 μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜。以1∶50比例取過夜培養(yǎng)物接種于含100 μg/ml卡那霉素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，至其D(600 nm)=0.6時加入IPTG（終濃度0.7 mmol/L）繼續(xù)培養(yǎng)，分別于1，2，3，5，10 h取1 ml菌液。以不含重組質(zhì)粒的空白菌培養(yǎng)物和未加IPTG誘導(dǎo)的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化細菌培養(yǎng)物為對照。

1.2.6 LDTI重組蛋白的電泳分析與蛋白質(zhì)印跡鑒定 將細菌培養(yǎng)物1 ml于4 ℃離心收集細菌，加適當(dāng)?shù)牡鞍咨蠘泳彌_液，煮沸5 min后進行15％TRICINESDSPAGE，經(jīng)考馬斯亮藍染色，確定蛋白有無表達。再以蛋白質(zhì)印跡方法鑒定此蛋白。

2 結(jié) 果

2.1 LDTI核酸片段擴增及純化

將PCR產(chǎn)物進行1.4%瓊脂糖凝膠電泳，可見到預(yù)期的141 bp大小的目的核酸片段（圖1）。

2.2 T載體克隆構(gòu)建

將純化的PCR產(chǎn)物與T載體連接后轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸埃希菌JM109，對目的片段大量擴增。按照質(zhì)粒小量抽提試劑盒說明書提取質(zhì)粒，進行測序鑒定，證實目的片段以正確的序列插入T載體（圖2）。

2.3 LDTI核酸片段原核表達載體的亞克隆

將酶切純化后的目的片段與表達載體pET28a連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸埃希菌JM109，獲得含有pET28aLDTI重組表達質(zhì)?；蚬こ叹Ｔ撝亟M質(zhì)粒大小為5.44 kb，經(jīng)NdeⅠ+Hind Ⅲ雙酶切后，切出大小與理論設(shè)計可切出大小5.306 kb+0.134 kb基本相符的兩條帶（圖3）。所篩選出的陽性重組質(zhì)粒經(jīng)進一步測序證明，所插入的核苷酸序列與目的片段序列完全一致，閱讀框架也正確無誤（圖4）。證實克隆到了全長的LDTI編碼序列，且無任何堿基突變，說明pET28aLDTI重組表達質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.4 LDTI重組蛋白的誘導(dǎo)表達以及鑒定

將重組質(zhì)粒pET28aLDTI轉(zhuǎn)化BL21(DE3)， IPTG（終濃度0.7 mmol/L）繼續(xù)培養(yǎng)，分別于1，2，3，5，10 h取1 ml菌液進行檢測。pET28aLDTI在誘導(dǎo)1 h后即可見到蛋白高效表達，占總蛋白的15%左右，在分子量約6.8 kD處有一特異性帶出現(xiàn)，與預(yù)期LDTI重組蛋白分子質(zhì)量相符合。隨著誘導(dǎo)時間延長，未見蛋白表達量明顯增加（圖5）。

M：蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；L1：BL21(DE3)空白菌；L2：pET28aLDTI轉(zhuǎn)化BL21(DE3)未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)；L3～7：pET28aLDTI轉(zhuǎn)化BL21(DE3)經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，t=1，2，3，5，10 h；L8：蛋白質(zhì)印跡鑒定結(jié)果

3 討 論

變態(tài)反應(yīng)性疾病是危害人類健康的一大類疾病，其發(fā)病率在西方約占總?cè)丝?5%，并有逐年上升的趨勢［4］。肥大細胞在變態(tài)反應(yīng)性疾病的發(fā)病機制中起重要作用，其作為變態(tài)反應(yīng)性炎癥的一個重要起始效應(yīng)細胞已被人們廣泛接受［5］，其含量最多的分泌性介質(zhì)類胰蛋白酶是近年來研究的重點。類胰蛋白酶已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)與多種疾病有關(guān)［6］，幾乎是專一性地由肥大細胞分泌，可以作為肥大細胞及其活化的特異性標(biāo)志［7］，因此其抑制劑很有希望成為一類新的抗炎藥物。對類胰蛋白酶抑制劑的研究也成為近10年來肥大細胞研究領(lǐng)域的熱點之一。研究表明，類胰蛋白酶抑制劑可降低哮喘患者對吸入性過敏原的哮喘樣反應(yīng)［8］，也有望成為治療纖維變性疾病如原因不明的肺纖維變性疾病或者硬皮病以及炎癥性腸病的一個新藥［9］。

目前國內(nèi)尚無關(guān)于重組水蛭源性類胰蛋白酶抑制劑基因工程的報道。本研究應(yīng)用所設(shè)計的上游引物NdeⅠ酶切位點及下游引物Hind Ⅲ酶切位點，將編碼LDTI氨基酸序列的核酸片段定向連接到質(zhì)粒pET28a的相應(yīng)位點，保證了插入片段方向的正確性。然后以含有LDTI目的序列的質(zhì)粒為模板進行PCR擴增，獲得了126 bp大小的目的片段LDTI全編碼區(qū)，首次構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET28aLDTI亞克隆，經(jīng)過雙酶切以及測序，證實獲得了pET28aLDTI重組質(zhì)粒，而后以IPTG誘導(dǎo)，使其在大腸埃希菌中得到表達。由于目的蛋白分子量較小，本實驗應(yīng)用15％TRICINESDSPAGE 進行小肽電泳，經(jīng)考馬斯亮藍染色以及蛋白質(zhì)印跡方法檢測、鑒定蛋白表達，最終獲得了大小約為6.8 kD的明顯特異性目的蛋白條帶。LDTI蛋白的成功表達為進一步研究LDTI蛋白的特性與功能奠定了良好的基礎(chǔ)。

（本文圖2，圖4見彩色插圖）

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蛋白酶抑制劑范文第3篇

【關(guān)鍵詞】半胱氨酸蛋白酶抑制劑C;測定方法;臨床應(yīng)用

血半胱氨酸蛋白酶抑制劑C（Cystatin C 又名胱抑素C）是目前發(fā)現(xiàn)的對組織蛋白酶B抑制作用最強的物質(zhì)，其生物學(xué)功能主要是調(diào)節(jié)半胱氨酸蛋白酶活性。因其分子量小，能自由通過腎小球濾過膜，幾乎完全被腎小管重吸收且不被分泌，能很好的替代肌酐而成為一種新的反映GFR的理想標(biāo)志物。隨著科學(xué)家對胱抑素C的深入研究，發(fā)現(xiàn)其不僅在腎臟疾病方面有臨床價值，而且還揭示了它與肝臟疾病、糖尿病、腫瘤等具有一定的相關(guān)性?，F(xiàn)就其在臨床疾病中的研究進展概述如下。

1血半胱氨酸蛋白酶抑制劑C的結(jié)構(gòu)和特性

1961年Clausen 于腦脊液中發(fā)現(xiàn)一種物質(zhì)，因它與哺乳動物胱蛋白A 和胱蛋白B 的結(jié)構(gòu)及活性相似，當(dāng)時被稱為胱蛋白C 。1985 年cystatin C 首次被報道可作為評估GFR 的指標(biāo)，稱為半胱氨酸蛋白酶抑制劑C 。其最重要的生理功能是調(diào)節(jié)半胱氨酸蛋白酶活性[1]。

Cystatin C 是一種非糖基化的堿性蛋白質(zhì)，由120 個氨基酸組成，相對分子質(zhì)量是13.36×103 ，等電點為9.3，特點為位于羧基端附近有2 個二硫鍵。人的cystatin C基因片段位于20 號染色體上，其基因序列在大多數(shù)組織中能穩(wěn)定表達。cystatin C是半胱氨酸蛋白酶抑制劑超家族2中的一員。半胱氨酸蛋白酶包括木瓜蛋白酶家族中的組織蛋白酶(主要存在于溶酶體中) 和Ca2+激活蛋白酶家族中的Ca2+激活蛋白(主要存在于細胞質(zhì)內(nèi)) 。它們在細胞內(nèi)肽類和蛋白質(zhì)代謝特別是膠原代謝中起重要作用。

Cys C的測定方法很多，包括單向免疫擴散法、酶免疫測定法、時間分辨熒光免疫法、放射免疫法、乳膠顆粒增強免疫比濁法等。

2CystatinC的臨床應(yīng)用

2.1Cys C與腎移植:腎臟移植目前已成為治療終末期腎病最有效的方法，因此腎臟移植手術(shù)后移植腎的功能監(jiān)測成為臨床工作之重點。2002年4月在德國馬爾堡召開的國際專家會議上[3]，與會專家一致認為，Cys C不受身高、性別、年齡、肌肉量的影響。王盛華等人的研究結(jié)果說明：健康人與非腎移植感染患者的Cys C濃度差異無統(tǒng)計學(xué)意義，故認為Cys C也不受感染因素影響。該研究還發(fā)現(xiàn)，Cys C在腎移植后診斷急性排斥反應(yīng)時明顯優(yōu)于血清肌酐(serum creatinine，Scr)，即Cys C比Scr提前（2.7±1.8）d升高；與排斥前比較，Cys C升高148.9％，遠高于Scr的43.9％。Le Bricon等也曾報道，Cys C在排斥時比Scr升高得更早、更明顯。

王盛華等人還發(fā)現(xiàn)，腎移植術(shù)后Scr緩慢下降，1周左右轉(zhuǎn)陰（低于判斷值122umol/L）而Cys C術(shù)后3d內(nèi)迅速下降，尤以第1天為著，可達69.2％，第2天91％的患者即轉(zhuǎn)為陰性（低于判斷值1.79mg/L），也有報道腎移植術(shù)后Cys C可立即下降（293±1.7）％。Cys C的這一優(yōu)勢在診斷加速性排斥反應(yīng)時得以發(fā)揮優(yōu)勢效果，而Scr雖有升高，但處于術(shù)后下降的背景中，不易觀察；而Cys C可立即由陰性轉(zhuǎn)為陽性，變化明顯。

2.2Cys C與肝臟疾病:Cys C與肝炎、肝硬化、肝癌： Cys C與肝臟疾病的關(guān)系少有報道。慢性肝病在發(fā)展成為肝硬化或肝癌的過程中，細胞外基質(zhì)蛋白量的改變是一個非常顯著的特征。腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移需要對周圍基底膜和組織成分的降解。因此，細胞外基質(zhì)合成與降解的失衡是肝硬化、肝纖維化，甚至肝癌發(fā)生的重要因素。有研究表明，基質(zhì)金屬蛋白酶/基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制物（MMPs和TIMPs）是肝病中細胞外基質(zhì)合成與降解的失衡原因之一。除MMP系統(tǒng)外，其它蛋白酶解系統(tǒng)也參與肝纖維化的形成，例如組織蛋白酶活性升高。國內(nèi)有相關(guān)報道，Cys C在肝臟疾病患者中顯著升高，且慢性肝炎、肝硬化和肝癌均有不同幅度的升高變化，推斷Cys C與肝病的嚴重程度相關(guān)。

2.3Cys C與糖尿病腎損害:糖尿病腎損害的主要病理改變?yōu)槟I小球基底膜受損，而作為全部腎功能單位濾過率的總和，GFR是評價腎功能受損的一項好的指標(biāo)，國內(nèi)外很多研究都說明Cys C在評價腎損害比Scr要更為靈敏、特異。

尿微量清蛋白對早期糖尿病腎病診斷有重要價值，但最近一些臨床研究發(fā)現(xiàn)，伴微量清蛋白尿的糖尿病患者僅有30%-45%，在10年內(nèi)進展到臨床糖尿病腎病。有人對23例僅尿mAlb一項為陽性，46例僅Cys C為陽性和其陽性而同時伴尿mAlb為陽性而未進行治療的糖尿病患者進行跟蹤調(diào)查測定，6個月內(nèi)復(fù)查上述指標(biāo)兩次，結(jié)果發(fā)現(xiàn)前者有7例病人兩次測定結(jié)果轉(zhuǎn)為陰性，后者僅有2例兩次測定結(jié)果恢復(fù)正常，證實單用尿mAlb診斷早期糖尿病腎病存在一定比例的假陽性，而Cys C的特異性較強，血清Cys C聯(lián)合尿mAlb測定可提高糖尿病早期腎損害診斷的正確率[4]。

2.4Cys C與妊娠高血壓綜合征:妊娠高血壓綜合征（簡稱妊高征）一直是產(chǎn)科的疑難雜癥之一。國內(nèi)有研究顯示，血清UA、Cr在中重度妊高征患者中較正常未孕者明顯增高（P

2.5Cys C與格林-巴利綜合征（Guillain Barre syndrome， GBS）:格林-巴利綜合征（Guillain Barre syndrome， GBS）是以周圍神經(jīng)和神經(jīng)根的脫髓鞘及小血管周圍淋巴細胞及巨噬細胞的炎性反應(yīng)為病理特點的自身免疫性疾病。在發(fā)展中國家發(fā)病率比較高，其病因和發(fā)病機制尚不明確。大量的實驗證明，GBS患者腦脊液中存在蛋白質(zhì)的異常表達，這為我們研究GBS提供了一個獨特的窗口。目前，國內(nèi)外已開始將蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)應(yīng)用于研究GBS患者腦脊液，從總體水平找到一些與GBS相關(guān)聯(lián)的蛋白質(zhì)[6]，但是這些蛋白與GBS的關(guān)系尚未完全明確。

有研究表明，Cystatin C可作為疼痛的腦脊液生物學(xué)標(biāo)記物，持續(xù)的疼痛誘導(dǎo)神經(jīng)系統(tǒng)Cystatin C的合成與釋放］。然而，本實驗GBS組中Cystatin C相對于對照組表達明顯下調(diào)，可能與GBS的主要癥狀的癱瘓與麻痹影響有關(guān)。

2.6Cys C與心血管動脈粥樣硬化（AS）:目前基礎(chǔ)研究證明動脈粥樣硬化（AS）是一種慢性炎癥過程，發(fā)病機制涉及細胞外基質(zhì)降解與血管壁重構(gòu)。

有關(guān)專家應(yīng)用免疫染色法與免疫雜交法發(fā)現(xiàn)動脈粥樣斑塊中cystatin C含量較正常血管減少，而組織蛋白酶S及K卻過度表達，認為cystatin C的缺失以及蛋白水解酶與其抑制劑的失平衡可能是AS的發(fā)病機制之一。Sukhova等對ApoE-1-小鼠的實驗研究結(jié)果也直接證明AS形成時cystatin蛋白酶／蛋白酶抑制劑失衡。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)CHD患者血清cystatinC濃度明顯低于對照組，表明了CHD患者存在低cystatin C血癥，這一結(jié)果支持cystatin C的缺失可能是AS的發(fā)病機制之一的結(jié)論，表明cystatin C對CHD患者可能有一定的保護作用。

3Cys C的臨床應(yīng)用展望

Cystatin C在體內(nèi)產(chǎn)生速率穩(wěn)定，影響因素極少， ，測定Cys C對疾病指導(dǎo)診斷及治療，具有重大的臨床意義Cys C在臨床上的應(yīng)用已經(jīng)不再局限于評價GFR了，它在很多疾病中的關(guān)聯(lián)也越來越明顯了。雖然目前的研究結(jié)果中還存在著很多的推測，但是隨著分子診斷學(xué)的發(fā)展，很多的難題定會得到解決。同時它將會廣泛應(yīng)用于臨床其他指標(biāo)的評價，其在疾病的發(fā)生、發(fā)展中勢必會發(fā)揮越來越大的作用。

參考文獻

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蛋白酶抑制劑范文第4篇

【關(guān)鍵詞】 糖尿?。桓哐獕?；腎病；血清胱氨酸蛋白酶抑制劑C

隨著人類生存環(huán)境及生活模式的改變，高血壓、糖尿病、腫瘤等疾病的發(fā)生率不斷上升，且可能伴發(fā)各種并發(fā)癥，如腎功能損害。因此，糖尿病腎病及高血壓腎病為臨床常見病，目前臨床用于診斷腎功能損害的方法有Cys C、BUN、Scr檢測等實驗室檢查方法，其中Cys C檢測是近些年迅速發(fā)展的用于診斷腎功能損害的重要診斷手段[1]。本文通過對我院糖尿病腎病患者、高血壓早期腎病患者進行Cys C的檢測，并以本院健康體檢者體內(nèi)Cys C水平為對照，探討研究Cys C的診斷價值。具體敘述如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2012年3月——2013年1月于我院就診的糖尿病腎病患者39例，作為糖尿病組，其中男21例，女18例，年齡22-63歲，平均（43.8±11.2）歲，納入標(biāo)準(zhǔn)符合WHO糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)。選取同期在我院就診的早期高血壓腎病患者41例，作為高血壓組，其中男19例，女22例，年齡22-63歲，平均（43.8±11.2）歲，納入標(biāo)準(zhǔn)符合WHO高血壓診斷標(biāo)準(zhǔn)。對照組為52例健康體檢合格者。三組入選者在年齡、性別方面無顯著差異。所有入選者均無原發(fā)性腎病及慢性腎臟疾病，無其他基礎(chǔ)性疾病。

1.2 方法 所有入選者同時檢測Cys C、Scr、BUN。早晨空腹抽取血樣，室溫條件下靜置30min，離心5min（3000r/min），取上層血清，要求4h內(nèi)測定完畢。收集24h尿液，準(zhǔn)確測量尿量，取5ml測定尿液中cr含量。

儀器設(shè)備為邁瑞全自動生化儀（BS-400），試劑為廣州科方生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)。Cys C、檢測采用的是免疫比濁法，BUN的測定方法為脲酶UV法，Scr的測定方法為氧化酶法。根據(jù)體表面積標(biāo)準(zhǔn)化法計算Ccr。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 使用SPSS18.0統(tǒng)計學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（χ±s）表示，數(shù)據(jù)用t檢驗，組間對比用X2檢驗，P

蛋白酶抑制劑范文第5篇

[關(guān)鍵詞] 慢性阻塞性肺??；黃芪多糖；基質(zhì)金屬蛋白酶-9；金屬基質(zhì)蛋白酶抑制劑-1

[中圖分類號] R56 [文獻標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2012）01（b）-025-03

Effect of astragalus polysaccharide on the expression of MMP-9 and TIMP-1 in lung tissue of COPD rats

YU Weiwei HUANG Xiaoyan ZHANG Yan XIA Qin

Department of General, Tongji Hospital Affiliated to Tongji Medical College of Huazhong University of Science and Technology, Hubei Province, Wuhan 430030, China

[Abstract] Objective To observe the influence of astragalus polysaccharide (ASP) on the expression level of MMP-9 and TIMP-1 in lung tissue of chronic obstructive pulmonary disease (COPD) rats. Methods 40 male Wistar rats were randomly divided into four groups, Normal group, COPD group, ASP group and prednisone group. The model of COPD was established by smoking method combined with endotracheal injection of lipopolysaccharide. After the drugs were administrated for 30 days，the lung function of rats were determined. The lung content of hydroxyproline was detected by biochemicaly method. The protein content of MMP-9 and TIMP-1 was determined semi-quantitatively by immunohistochemical methods. Results The COPD group showed chronic obstructive pulmonary histopathologic change, the lung function decreased, the expression MPO, MMP-9 and TIMP-1 increased, MMP-9/TIMP-1 decreased; after intervention of ASP and prednisone, the pulmonary histopathologic change and the lung function improved, the expression MPO, MMP-9, TIMP-1 and MMP-9/TIMP-1 decreased, there was a negative correlation between FEV0.2/FVC and MMP-9/TIMP-1. Conclusion ASP can effectively inhibit the expression of MMP-9 and TIMP-1, improve the lung function and ECM imbalance of degradation and sedimentary, and delay airway remodeling.

[Key words] Chronic obstructive pulmonary disease； Astragalus polysaccharide；Matrix metalloproteinases-9; Tissue inhibitor of metalloproteinases-1

慢性阻塞性肺疾?。–OPD）是具有呼吸道阻塞特征的慢性支氣管炎，其形成過程包括肺泡巨噬細胞、T淋巴細胞和中性粒細胞增加，激活炎癥細胞釋放多種介質(zhì)進一步刺激細胞外基質(zhì)（ECM）沉積，導(dǎo)致呼吸道狹窄和呼吸道阻力增加。抑制炎性介質(zhì)的釋放和氣管的纖維化對防治COPD及其并發(fā)癥、改善患者的生活質(zhì)量具有重要意義。近年來，黃芪多糖在多種急、慢性炎癥中突出的免疫調(diào)節(jié)作用引起了人們的關(guān)注，本實驗擬采用觀察黃芪多糖對COPD大鼠肺組織中基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）、金屬基質(zhì)蛋白酶抑制劑-1（TIMP-1）表達的影響，來進一步探討黃芪多糖對COPD的作用機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

黃芪多糖（四川百利藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號：080606）；脂多糖（LPS）（Sigma公司）；香煙（云南紅河卷煙廠軟乙香煙，尼古丁含量：1.3 mg；焦油含量：14 mg）；強的松片（西安利君沙制藥股份有限公司）；羥脯氨酸（MPO）試劑盒（南京建成生物工程研究所）；MMP-9、TIMP-1抗體（武漢博士德公司）。

1.2 模型的建立、分組與標(biāo)本處理

健康Wistar雄性大鼠（華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院實驗動物學(xué)部提供）40只，平均體重250~300 g，適應(yīng)性飼養(yǎng)環(huán)境1周后采用隨機數(shù)字法將動物分為4組：正常對照組、COPD組、黃芪多糖組、強的松組，每組10只。①正常對照組：未作任何干預(yù)，每日用1 mL生理鹽水灌胃作為對照；②COPD組：第1、16天，氣管內(nèi)注入1 g/L的LPS 200 μL/次，第2~15天和第17~30天將大鼠放入有機玻璃熏箱內(nèi)被動吸煙，每天熏煙2次，每次20支香煙，時間持續(xù)1 h，2次熏煙間隔4 h，每天熏煙前0.5 h以1 mL生理鹽水灌胃作為對照；③黃芪多糖組：模型制備方法同COPD組，但每天熏煙前0.5 h以蒸餾水溶解黃芪多糖顆粒灌胃（40 mg/kg）；④強的松組：模型制備方法同COPD組，將強的松片研成粉末，加蒸餾水溶解，熏煙前0.5 h按6 mg/kg灌胃。

1.3 觀測指標(biāo)及方法

1.3.1 取材方法 到第31天時，大鼠經(jīng)股動脈放血處死，打開胸腔結(jié)扎右主支氣管，取右下葉部分肺組織待檢測羥脯氨酸含量，余右肺組織以10%的中爾馬林固定，24 h以后石蠟包埋、切片，常規(guī)HE染色鏡檢。左肺用10%的中爾馬林固定20 min，常規(guī)脫水，透明，浸蠟包埋，待免疫組化檢測。

1.3.2 肺組織中羥脯氨酸含量測定 取大鼠肺組織用勻漿器在冰浴下制成10%勻漿，3 000 r/min離心10 min，取上清，按照羥脯氨酸試劑盒說明書進行操作，考馬斯亮藍法測定肺組織羥脯氨酸蛋白含量。

1.3.3 肺功能檢測 處死動物前采用AniRes動物肺功能儀進行大鼠肺功能測定。以3%戊巴比妥鈉70 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，氣管插管，將大鼠放進體掃描儀內(nèi)，連接動物肺功能儀，描記一段平靜呼吸后，在呼氣末以相當(dāng)于潮氣量4倍的氣量充氣（相當(dāng)于深呼氣），所引起的容積變化經(jīng)微機處理算出0.2 s用力呼吸量（FEV0.2）、FEV0.2與用力肺活量比值（FEV0.2/FVC）以及吸氣阻力（Ri）、呼氣阻力（Re）。

1.3.4 肺組織MMP-9和TIMP-1蛋白含量測定 取左肺石蠟切片（6 μm）作免疫組織化學(xué)染色（SP法）。免疫組化染色以細胞胞漿中出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒為陽性反應(yīng)，每組染色切片隨機選取10個視野，經(jīng)圖像掃描測定每組免疫反應(yīng)陽性信號強度的平均吸光度（A），求出平均值，然后用統(tǒng)計學(xué)方法進行半定量分析。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 13.0軟件包進行統(tǒng)計學(xué)處理，計量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，對相關(guān)指標(biāo)進行Spearman法直線相關(guān)分析。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠肺組織病理改變

光鏡下觀察，正常對照組肺組織結(jié)構(gòu)基本正常，COPD組大鼠肺泡壁增厚，間質(zhì)內(nèi)大量炎癥細胞浸潤，肺泡間隔明顯增寬，局部可見代償性肺氣腫，證實造模成功，黃芪多糖組及強的松組肺泡壁增厚較COPD組有所減輕，炎性細胞浸潤減少。

2.2 大鼠肺功能水平

與正常對照組比較，COPD組FEV0.2、FEV0.2/FVC均顯著減少，Re、Ri顯著增大（均P < 0.05）；與COPD組比較，黃芪多糖組和強的松組FEV0.2、FEV0.2/FVC均增多，Re、Ri減少（均P < 0.05），其中強的松組改善最為顯著。見表1。

2.3 大鼠肺組織羥脯氨酸含量

COPD組大鼠肺組織羥脯氨酸含量較正常對照組明顯增加（P < 0.01）；黃芪多糖和強的松干預(yù)后，羥脯氨酸含量明顯減少（P < 0.05或P < 0.01）。見表2。

2.4 大鼠肺組織中MMP-9、TIMP-1、MMP-9/TIMP-1蛋白水平

COPD組大鼠肺組織MMP-9、TIMP-1、MMP-9/TIMP-1水平較正常對照組明顯增加（P < 0.05或P < 0.01）；黃芪多糖和強的松干預(yù)后，MMP-9、TIMP-1、MMP-9/TIMP-1水平明顯降低（P < 0.05或P < 0.01）。見表2。

表2 大鼠肺組織羥脯氨酸、基質(zhì)金屬蛋白酶-9、

金屬基質(zhì)蛋白酶抑制劑-1含量變化（x±s）

注：與正常對照組比較，#P < 0.01，*P < 0.05；與COPD組比較，##P < 0.01，P < 0.05

2.5 相關(guān)性分析

正常對照組、COPD組、黃芪組、強的松組肺組織MMP-9/TIMP-1水平與FEV0.2/FVC呈負相關(guān)（相關(guān)系數(shù)r = -0.411、-0.621、-0.684、-0.542，均P < 0.05）。

3 討論

COPD是一種以進行性的氣流阻塞和持續(xù)性的炎癥過程為特征的疾病，目前認為其病變早期是以炎癥細胞浸潤為主，后期表現(xiàn)為ECM沉積在氣道壁導(dǎo)致細支氣管壁的增厚和呼吸道重建[1-2]。ECM的降解和沉積失衡是導(dǎo)致氣道壁結(jié)構(gòu)異常構(gòu)建、肺實質(zhì)破壞和間質(zhì)增生的重要原因?；|(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）是一組具有相同功能、結(jié)構(gòu)高度同源、依賴鋅離子的內(nèi)肽酶的總稱，MMP-9是MMPs家族的重要成員，能降解氣道和肺泡的ECM和基底膜，參與其重構(gòu)和炎細胞趨化，在COPD的發(fā)病中占重要地位[3]，TIMPs是MMPs的內(nèi)源性天然抑制因子，能與MMPs形成1∶1復(fù)合體抑制其活性，它有五種亞型，其中TIMP-1是活性最強的一種，能特異性抑制MMP-9的活性，TIMP-1還具有細胞生長因子樣作用，能使ECM沉積并抑制其降解，是氣道纖維化的標(biāo)志，反映了呼吸道修復(fù)重塑的過程[4]。MMP-9/TIMP-1的平衡是維持ECM正常狀態(tài)所必須的，一旦平衡打破則出現(xiàn)病理狀態(tài)，MMP-9/TIMP-1比值升高，表明呼吸道以炎癥反應(yīng)為主，將引起組織破壞，MMP-9/TIMP-1比值下降，表面呼吸道以修復(fù)為主，過度降低（尤其是TIMP-1過度升高時）將出現(xiàn)纖維化可能[5]。本試驗中，COPD組MMP-9及TIMP-1均較正常組明顯升高，MMP-9、TIMP-1、MMP-9/TIMP-1水平的升高與COPD肺功能的下降、羥脯氨酸水平的升高有相關(guān)性，羥脯氨酸是反應(yīng)組織纖維化程度的重要指標(biāo)，上述結(jié)果提示MMP-9、TIMP-1在肺組織的損傷及纖維化方面起著重要作用。

COPD屬于中醫(yī)咳嗽、痰飲、喘癥的范疇，其病因與外邪入侵和內(nèi)傷有關(guān)，中醫(yī)理論認為肺主氣，朝百脈，乃是氣、血、津液匯聚之地，氣虛、血淤是COPD形成的重要病理基礎(chǔ)[6]，而中藥黃芪多糖是傳統(tǒng)補氣中藥，可補氣血，去淤散結(jié)，有助于氣血暢行，目前黃芪多糖在調(diào)節(jié)免疫方面的作用倍受關(guān)注，既往有試驗提示黃芪多糖可以抗纖維化[7]，故本試驗將黃芪多糖作為干預(yù)藥物，觀察其對肺組織病理、MPO、MMP-9、TIMP-1、MMP-9/TIMP-1表達的影響，并將其與強的松作對比來觀測其療效。試驗結(jié)果顯示：黃芪多糖能使肺泡壁間隔增厚減輕，炎性細胞浸潤減少，并能部分改善局灶性肺氣腫，肺功能改善，使MPO、MMP-9、TIMP-1表達減少，MMP-9/TIMP-1比值減低，其作用與強的松有類似之處。據(jù)此筆者推論：黃芪可能通過降低肺組織羥脯氨酸的水平，抑制肺組織中MMP-9、TIMP-1的含量，降低MMP-9/TIMP-1比值來使ECM的合成和降解趨于平衡，這一作用有助于改善呼吸道的無效重構(gòu)和肺纖維化程度，因此肺功能得以改善。同時顯示，黃芪多糖及強的松對肺功能的改善和MMP-9/TIMP-1的降低呈正相關(guān)，與之前MMP-9/TIMP-1比值減低時肺損傷傾向于修復(fù)的觀點一致，但本試驗結(jié)果顯示，使用黃芪多糖和強的松后，MPO降低，與之前的MMP-9/TIMP-1比值降低肺部病變傾向于修復(fù)、有纖維化可能似乎有矛盾，但表2顯示，使用黃芪多糖后，MMP-9的減低幅度顯著高于TIMP-1，導(dǎo)致MMP-9/TIMP-1降低的主因是MMP-9的減低，提示黃芪多糖可能通過改善MMP-9/TIMP-1的比例來改善肺纖維化。對于黃芪多糖是通過何種途徑來影響MMP-9及TIMP-1的表達目前知之甚少，黃芪多糖對肺炎性因子表達的影響亦不清楚，這對進一步理解其作用機制有著重要意義，可作為下一步的研究目標(biāo)。

目前對抑制MMP-9的表達及減輕肺損傷的藥物的研究正成為藥理學(xué)的研究熱點，一系列合成抑制物在動物試驗中已發(fā)揮明顯作用，但也因副作用而受到制約。中藥黃芪多糖毒副作用小，整體改善患者病情，本試驗進一步證實了其在COPD中的療效，提示黃芪多糖可能通過影響MMP-9/TIMP-1的比值來促進肺組織的修復(fù)。

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