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纖維素酶范文第1篇

纖維素是煙草中主要的細(xì)胞壁物質(zhì)，其含量高低直接影響煙葉的品質(zhì)。低等級煙葉由于纖維素含量較高，其煙氣會產(chǎn)生強(qiáng)烈的刺激性、嗆咳、澀口、枯焦氣［1］，因此，測定煙草中的纖維素，對于評價(jià)煙葉品質(zhì)具有重要意義。傳統(tǒng)的測定方法主要采用稀酸、稀堿與樣品依次共煮后用有機(jī)溶劑處理，再經(jīng)烘干后稱重［2-4］，這種方法操作繁瑣，費(fèi)力耗時(shí)，且由于操作人員的技術(shù)差異會帶來很大的誤差。近年來，近紅外（NIR）光譜分析技術(shù)也被用于煙草中纖維素含量的測定［5］，但是因其數(shù)據(jù)模型的建立需要大量的數(shù)據(jù)支撐，其應(yīng)用受到一定的局限。根據(jù)纖維素水解后生成葡萄糖的性質(zhì)，采用酶解纖維素得到葡萄糖［6-7］，然后利用流動分析儀檢測還原糖含量［8］，可計(jì)算得到纖維素的含量，而且酶水解具有專一性和高效性［9-10］，流動分析儀在行業(yè)內(nèi)的應(yīng)用也比較廣泛，因此，建立測定煙草中纖維素含量的流動分析法，可為評價(jià)煙葉的品質(zhì)提供技術(shù)支持。

1材料與方法

1.1材料、試劑與儀器2009年初烤煙葉樣品17個(gè)（川渝中煙工業(yè)公司提供）。冰醋酸、檸檬酸、檸檬酸三鈉（AR，重慶川東化工有限公司化學(xué)試劑廠）；葡萄糖、氯化鈣、氫氧化鈉（AR，重慶北碚化學(xué)試劑廠）；纖維素酶（BR，活力>15000DU，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；聚乙氧基月桂醚、對羥基苯甲酸酰肼（AR，荷蘭Skalar公司）。SkalarSan++流動分析儀（荷蘭Skalar公司）；AX504分析天平（感量：0.0001g，瑞士MettlerToledo公司）；恒溫?fù)u床（中國科學(xué)院武漢科學(xué)儀器廠）；循環(huán)水真空泵（鞏義市英峪予華儀器廠）；G3玻璃砂心漏斗（長春市玻璃儀器廠）。

1.2樣品處理和分析準(zhǔn)確稱取0.25g40目煙粉，置于100mL錐形瓶中，加入25mL5%醋酸溶液，搖床振蕩萃取30min，萃取出樣品本身含有的水溶性糖［8］，用G3漏斗過濾，濾渣用蒸餾水沖洗3次，每次50mL；將濾渣轉(zhuǎn)移到100mL錐形瓶中，加入60mL含有0.25g纖維素酶的檸檬酸/檸檬酸三鈉緩沖溶液（pH4.7）［7，11］，然后放入37℃恒溫?fù)u床水解24h；水解結(jié)束后將樣品冷卻至室溫，過濾，用蒸餾水將濾液定容至100mL，利用流動分析儀測定樣品液中的葡萄糖，測得葡萄糖含量乘以轉(zhuǎn)換系數(shù)0.9（由纖維素水解方程式計(jì)算得到）即得纖維素含量。

2結(jié)果與討論

2.1酶解條件的選擇

2.1.1緩沖溶液用量對纖維素水解的影響準(zhǔn)確稱取0.25g煙粉樣品5份，按照1.2的方法除水溶性糖，然后分別加入固定纖維素酶量（0.25g纖維素酶）的緩沖溶液40，50，60，70，80mL，在固定溫度（37℃）條件下水解24h，纖維素含量的測定結(jié)果如圖1所示。由圖1可知，隨著緩沖液體積的增大，纖維素測定量也逐漸升高，當(dāng)緩沖溶液用量為60mL時(shí)，達(dá)到最高值，說明此時(shí)纖維素水解完全；當(dāng)緩沖溶液用量大于60mL后，纖維素測定量逐漸降低，這可能是由于緩沖溶液用量過大，導(dǎo)致了酶濃度降低，酶不能與底物充分接觸，從而使酶解效果變差。因此，選擇緩沖液用量為60mL。

2.1.2酶用量對纖維素水解的影響在緩沖液用量為60mL、其他條件不變的情況下，分別考察酶用量為0.05，0.10，0.15，0.20和0.25g時(shí)的酶解效果，結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，當(dāng)酶用量為0.20g時(shí)，纖維素測定量最高，考慮到生物酶較容易部分失活，為保證纖維素水解完全，所以確定酶用量為0.25g。

2.1.3溫度對纖維素水解的影響在緩沖液用量為60mL和酶用量為0.25g的情況下，分別考察纖維素在30，35，40，45和50℃下的水解效果，結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，當(dāng)溫度<35℃時(shí)，纖維素水解不完全，測定量較低；當(dāng)溫度>40℃時(shí)，纖維素測定量降低，這可能是因?yàn)闇囟冗^高導(dǎo)致酶失活，使纖維素水解不完全；較適宜的水解溫度為35~40℃，實(shí)驗(yàn)選擇37℃。

2.1.4時(shí)間對纖維素水解的影響在緩沖液用量為60mL、酶用量為0.25g和水解溫度為37℃的情況下，分別水解20，22，24，26和28h，結(jié)果（圖4）表明，24h后，纖維素水解完全，所以確定水解時(shí)間為24h。

2.2工作曲線與檢測限準(zhǔn)確稱取2.2009g葡萄糖，用蒸餾水溶解并定容至100mL，搖勻，得標(biāo)準(zhǔn)儲備液。移取1，2，3，4，5mL標(biāo)準(zhǔn)儲備液，分別用蒸餾水稀釋并定容至100mL，搖勻，即得葡萄糖系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，濃度分別為0.2，0.4，0.6，0.8和1.0mg/mL，相當(dāng)于纖維素0.18，0.36，0.54，0.72，0.90mg/mL。用流動分析儀測定標(biāo)準(zhǔn)溶液中的葡萄糖含量，并對電信號響應(yīng)值Y（峰高，DU），與其濃度X（纖維素含量，mg/mL）進(jìn)行線性回歸分析，得其工作曲線回歸方程為：Y=15893.3X+2117.5，r=0.9998?？梢钥闯觯w維素在0.18~0.90mg/mL濃度范圍內(nèi)，工作曲線線性良好，適合于定量分析。通過測定空白試樣，測得纖維素的檢測限［12］為0.11mg/mL。

2.3精密度和回收率采用本方法對煙草樣品的纖維素分別測定6次，測定量分別為125.8，120.7，126.9，127.3，126.2和125.1mg/g，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為2.40%，說明本方法的重復(fù)性較好。在脫糖煙草樣品中加入葡萄糖，測定其回收率，結(jié)果如表1所示。纖維素的回收率為96.7%~103.8%，說明本方法的準(zhǔn)確性較高。

2.4與經(jīng)典方法［3］比較分別用本方法和經(jīng)典方法測定16個(gè)煙草樣品的纖維素含量，結(jié)果如表2所示。通過對兩組數(shù)據(jù)進(jìn)行配對樣品t檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)二者無顯著性差異，說明該方法適合于煙草中纖維素含量的檢測。

纖維素酶范文第2篇

【關(guān)鍵詞】 纖維素酶； 結(jié)構(gòu)；進(jìn)展

纖維素類物質(zhì)是自然界中最廉價(jià)、最豐富的一類可再生資源。如果將天然纖維素降解為可利用的糖類物質(zhì)，再進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為乙醇、菌體蛋白、氣體燃料等物質(zhì)，對解決當(dāng)今世界所面臨的環(huán)境污染、資源緊張和能源危機(jī)等問題具有重大現(xiàn)實(shí)意義。而降解纖維素效果最好的是纖維素酶。它是一類能夠?qū)⒗w維素降解為葡萄糖的多組分酶系的總稱，它們協(xié)同作用，將纖維素降解為寡糖和纖維二糖，最終水解為葡萄糖。

1 纖維素酶的來源

纖維素酶的來源很廣泛，真菌、細(xì)菌、放線菌等均有能產(chǎn)生纖維素酶的報(bào)道。目前國內(nèi)外最主要的是利用真菌來發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶。目前，綠色木霉和黑曲霉被公認(rèn)是產(chǎn)纖維素酶最穩(wěn)定和無毒安全的菌種，對研究纖維素酶的性質(zhì)以及分離純化等都比較方便。

2 纖維素酶的種類及降解機(jī)理

習(xí)慣上將纖維素酶分成三種主要成分：(1)外切型葡聚糖酶：(C1酶, ) ; (2)內(nèi)切型葡聚糖(Cx酶）；( 3)β - 葡聚糖苷酶( 纖維二糖酶)。

C1酶主要作用于不溶性纖維表面，使纖維素結(jié)晶鏈開裂，長鏈纖維素分子末端部分游離和暴露，使纖維素易于水化，經(jīng)C1酶作用后的纖維素分子結(jié)晶結(jié)構(gòu)被破壞，Cx酶即吸附在纖維素分子上面，從鍵的內(nèi)部任意位置切開β - 1, 4 - 糖苷鍵，將纖維素分子斷裂為纖維二糖和纖維三糖等。最后這些被裂解產(chǎn)物由β - 葡聚糖苷酶分解為葡萄糖。

2.1 纖維素酶對纖維素分子的吸附作用 纖維素酶對纖維素的降解是從吸附于纖維素分子開始的，纖維素酶的吸附不僅與酶本身性質(zhì)有關(guān)，也與底物的特性有密切相關(guān)，而吸附過程是否可逆視具體酶的種類而定。此外，纖維素酶的吸附機(jī)制并未弄清，仍需做進(jìn)一步研究 。

2.2 纖維素酶中單個(gè)組分的作用機(jī)制 纖維素酶的斷鍵機(jī)理與溶菌酶一樣,遵循雙置換機(jī)制。兩個(gè)色氨酸參與基質(zhì)結(jié)合，而處在與將被裂解的鍵相鄰的一個(gè)非離子化谷氨酸殘基參與催化作用。這些殘基被非極性的側(cè)鏈基團(tuán)圍繞，以促進(jìn)質(zhì)子轉(zhuǎn)移。

2.3 纖維素酶的協(xié)同降解作用 纖維素酶三種酶組分的協(xié)同作用如上所述，即外切酶作用于不溶性纖維素表面，使纖維素結(jié)晶鏈開裂，長鏈纖維素分子末端部分游離和暴露，纖維素易于水化；內(nèi)切酶則作用于經(jīng)C1酶活化了的纖維素分子，分解其β -1，4- 鍵，產(chǎn)生纖維二糖和纖維三糖等短鏈低聚糖；β - 葡聚糖苷酶再將這些短鏈低聚糖分解成葡萄糖.。然而，該協(xié)同作用中的各種酶的作用順序并不是固定不變的。

3 纖維素酶的結(jié)構(gòu)

國內(nèi)外大量的研究認(rèn)為，纖維素酶分子普遍具有類似的結(jié)構(gòu),由球狀的纖維素催化結(jié)構(gòu)域(Catalyticdomains, CD)，纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域( Cellulose - Binding Dom sins, CBD)和連接橋(Linker)三部分組成。不同來源的纖維素酶盡管具有不同的分子量，但是其催化區(qū)域CD的大小卻基本一致；纖維素酶的結(jié)合結(jié)構(gòu)域CBD主要可維持酶分子的構(gòu)象穩(wěn)定性，調(diào)節(jié)酶對可溶性和非可溶性底物的結(jié)合專一性。連接橋Linker可保持CD和CBD之間的距離，有助于不同酶分子間形成較為穩(wěn)定的聚集體。

在對CD的研究中，研究者們?yōu)榱舜_定纖維素酶中哪個(gè)氨基酸是酶催化的必需氨基酸，用定點(diǎn)突變的技術(shù)，在已知的核苷酸序列中準(zhǔn)確地誘變密碼子中的一個(gè)或數(shù)個(gè)堿基，改變組成酶的一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸殘基，從而確定功能性氨基酸基團(tuán)。目前國內(nèi)外的研究主要對纖維素酶所屬的第5，7，9等族纖維素酶。而對于其它族的研究，還有待進(jìn)一步研究。

4 纖維素酶的制備

對纖維素酶的制備一般采用微生物發(fā)酵方法。發(fā)酵方法可分為固體發(fā)酵法和液體深層發(fā)酵法兩種。而采用何種發(fā)酵法取決于具體情況，如隨著現(xiàn)在實(shí)驗(yàn)室的快速發(fā)展，很多研究機(jī)構(gòu)采用發(fā)酵柜來發(fā)酵產(chǎn)酶，使我們在有限的空間里用較少的成本便可以達(dá)到產(chǎn)酶的目的。

5 纖維素酶的應(yīng)用

目前纖維素酶的應(yīng)用還主要集中在微生物纖維素酶的應(yīng)用上?，F(xiàn)在已被廣泛地應(yīng)用于食品、釀酒、飼料加工、紡織、洗衣、農(nóng)業(yè)等多個(gè)領(lǐng)域中。

啤酒和葡萄酒的釀造工藝具有十分悠久的歷史。在低質(zhì)量大麥的發(fā)芽過程中加入纖維素酶可水解β-1，3-和β-1，4-葡聚糖，從而幫助大麥發(fā)芽，提高啤酒的過濾效率，并能增加葡萄酒的香味。

此外，纖維素酶也已被用在造紙、植物和真菌原生質(zhì)體的制備以及農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中。

總之，纖維素酶是目前糖苷酶類中惟一尚有大量亟待解決問題的酶，也是有著巨大工業(yè)和市場潛力的酶。進(jìn)一步闡明纖維素酶的結(jié)構(gòu)與功能，研究纖維素酶的基因表達(dá)與調(diào)控的關(guān)系；針對不同工業(yè)需要研制不同組分比例的纖維素酶；高纖維素酶水解天然纖維素的比活力；開發(fā)適應(yīng)不同溫度(低溫或高溫纖維素酶)的纖維素酶是當(dāng)前纖維素酶的主要研究趨勢。

參考文獻(xiàn)

纖維素酶范文第3篇

關(guān)鍵詞：羧甲基纖維素酶；濾紙酶；β-葡萄糖苷酶；曲霉A25

中圖分類號 S154 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 1007-7731（2016）08-22-04

Abstract：67 strains of soil bacteria were isolated form farmland，from which a high-yielding cellulase strain was screened.These strains were inoculated on the cellulose medium，and a preliminary screening was conducted，in which we measured hydrolysis transparent circle and the ratio of the size of the colony under pH5.5 and 28℃ conditions by using the Congo Red staining.Furthermore，these selected strains were cultured，and a crude enzyme liquid was extracted for analyzing the activities of carboxymethyl cellulose（CMC），filter paper enzyme（FP）and β-glucosidase（BG）.Under different temperature conditions，the activity of cellulase was determined，and ultimately this one strain of Aspergillus A25 was obtained.Its great activity is under the condition of optimum temperature for 50 ℃.Producing cellulose enzyme activity was as following：CMC amounted to 2 340.92 U/mL，F(xiàn)P activity amounted to 2.66 U/mL，and BG activity amounted to 164.72 U/mL.

Key words：Cerboxymethl cellulose；Filter paper enzyme；β- glucosidase；Aspergillus A25

纖維素物質(zhì)是地球上含量最豐富的碳水化合物[1]，而目前人類對纖維素的開發(fā)與利用還非常有限，因此如何更有效地開發(fā)和利用纖維素資源已成為當(dāng)今世界的熱門課題之一。目前，對纖維素的降解利用主要是用酸堿處理等化學(xué)手段，以及汽爆及蒸汽加熱等物理手段[2]。生物法由于對設(shè)備要求低，分解后的產(chǎn)物易回收利用，以及對環(huán)境污染較小等特點(diǎn)而備受重視。纖維素是一個(gè)復(fù)雜酶系，根據(jù)其功能的不同可分為3類：作用于纖維素非結(jié)晶區(qū)的內(nèi)切葡聚糖酶（CMC）；作用于無定型區(qū)切割糖苷鍵的外切葡聚糖酶（FP）；以及作用于纖維二糖的β-葡萄糖苷酶（BG）[3-5]。協(xié)同作用才能將結(jié)構(gòu)復(fù)雜的天然纖維降解。纖維素酶在食品、洗滌、紡織、飼料、造紙等方面具有廣泛的應(yīng)用和發(fā)展前景[5]。通過對本實(shí)驗(yàn)室保存的67株菌株進(jìn)行初篩和復(fù)篩，A25這一株菌株是本次實(shí)驗(yàn)所篩選的，具有較高降解纖維素活力的菌株，本文對其纖維素酶的生產(chǎn)培養(yǎng)特性進(jìn)行研究，對于了解其降解機(jī)制以及實(shí)際應(yīng)用都有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料 從農(nóng)田土壤中分離得到67株土壤細(xì)菌。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 DNS法標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 稱0.05g經(jīng)105℃烘干至恒重的葡萄糖溶于少量蒸餾水中，用蒸餾水定溶至500mL配制成濃度為50μg/mL的葡萄糖溶液。取0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL和1.2mL葡萄糖溶液再加入蒸餾水將體積配制至10mL。再分別從中取2mL，再加蒸餾水1.0mL再加DNS試劑2.0mL搖勻，置于沸水中煮沸5min，取出置與冷水中冷卻到室溫，測其OD530值。根據(jù)OD值，以葡萄糖濃度為縱坐標(biāo)，吸光值為橫坐標(biāo)，列出直線回歸方程（Y=aX+b）。

1.2.2 產(chǎn)纖維素酶菌株的培養(yǎng) 在無菌條件下，將67株菌株接種到纖維素培養(yǎng)基中，放在培養(yǎng)箱里溫度為28℃，培養(yǎng)48h。

1.2.3 剛果紅染色 把培養(yǎng)好的霉菌用剛果紅染色劑覆蓋培養(yǎng)皿一層進(jìn)行染色30min。然后用0.9%生理鹽水沖洗2～3次，觀察其透明圈的大小，并計(jì)算出H/C的比值即酶活，（酶活性=透明圈直徑的值與菌落直徑的比值）。根據(jù)比值的大小進(jìn)行初步篩選。

1.2.4 粗纖維酶液的制備 在無菌操作下，將初步篩選的7株霉菌分別接種到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，搖瓶培養(yǎng)3～4d，溫度為28℃，轉(zhuǎn)速為160r。

1.2.5 纖維素酶發(fā)酵液的處理 纖維素酶霉菌搖瓶培養(yǎng)好后，用循環(huán)水式抽濾機(jī)進(jìn)行抽濾。將濾液轉(zhuǎn)入到原三角燒瓶中，放入冰箱備用。

1.2.6 酶活力的測定 采用DNS法（3，5-二硝基水楊酸比色法）[6-7]。

1.2.7 羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）酶活力測定 以2.0mL 20%（w/v）羧甲基纖維素鈉溶液為底物，用pH5.0檸檬酸緩沖液配制）。加1mL稀釋酶液于50℃，恒溫水浴反應(yīng)30min，然后加入2mL DNS顯色液，終止反應(yīng)，煮沸5min，再放入冰水中冷卻至室溫。用722S分光光度計(jì)在530nm處測定光密度OD值，同時(shí)相同條件作空白樣調(diào)零。

1.2.8 濾紙（FP）酶活力測定 精確吸取4.0mL稀釋酶液和1.0mL pH4.6的乙酸-乙酸鈉緩沖液，置于試管中，加入新華5號濾紙條（1×3cm）一條，滴入甲苯2～3滴防腐。40℃反應(yīng)24h。吸取上述濾紙酶液2.0mL加入蒸餾水1.0mL，2.0mL DNS顯色液，終止反應(yīng)。沸水煮沸5min，然后再放入冷水中冷卻至室溫。在530nm處測定光密度OD值，同時(shí)相同條件下作空白調(diào)零。

1.2.9 β-葡萄糖酶（BG）活法測定 取1.0mL稀釋酶液加2.0mL pH4.6乙酸-乙酸鈉緩沖液配制的1%的水楊酸溶液，50℃酶解30min，加入2.0mL DNS顯色液，終止反應(yīng)，于沸水中水浴5min，用冷水冷卻至室溫，在530nm處測定其OD值，同時(shí)相同條件下作空白調(diào)零。

1.4 濾紙崩潰實(shí)驗(yàn) 取稀釋酶液4.0mL和1.0mL pH4.6的乙酸-乙酸鈉緩沖液置于試管中。（15×50cm）加入新華5號濾紙條（1×3cm）一條，滴入甲苯2～3滴（防腐），于恒溫箱內(nèi)40℃保溫24h。觀察濾紙崩潰情況，觀測標(biāo)準(zhǔn)如下：+++表示濾紙完全沉在底部，搖動試管后濾紙呈糊狀；++表示濾紙完全下沉，搖后呈小片狀；+表示濾紙沿底部呈毛狀，搖后部分溶化；-表示濾紙直立完整無缺，搖后不溶化。

1.5 還原糖含量的測定 采用DNS法[9]測還原糖。

2 結(jié)果與分析

2.1 高產(chǎn)纖維素酶菌株的初篩 將67株菌株接種到羧甲基固體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)48h，用剛果紅染色靜止30min后測其H/C的比值，結(jié)果見表2。

從本實(shí)驗(yàn)室保存的67株菌株中，將各菌株分別采用纖維素固體培養(yǎng)基進(jìn)行富集培養(yǎng)并進(jìn)行篩選，從中篩選出高產(chǎn)纖維素酶菌株。從表2這些菌株的透明圈的直徑與菌落的直徑比值大小可以看出，A25、A5、O7、O8O9、D2、H7、HD的H/C比值較高，這7株產(chǎn)纖維素酶能力較強(qiáng)，紅色水解透明圈較明顯、較大，具有較高的纖維素酶活力。H/C是透明圈與菌落的比值，比值越大酶活越強(qiáng)。根據(jù)紅色水解透明圈出現(xiàn)的快慢、大小可大致得出該菌株的產(chǎn)纖維素酶情況，這可作為初次判斷的依據(jù)。通過表2的結(jié)果說明A25、A5、O7、O8O9、D2、H7、HD7株菌株具有較高的酶活力。

2.2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 參照1.2.1所描述的方法制備出標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖曲線（圖1），根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖曲線求出直線回歸方程y=0.003 4x-0.505，R2=0.996 8（y：葡萄糖濃度，x：OD530的值），通過直線回歸方程可以計(jì)算纖維素酶酶促反應(yīng)中產(chǎn)生葡萄糖的濃度，從而根據(jù)酶活力單位定義算出酶活。

2.3 高產(chǎn)纖維素酶菌株的復(fù)篩 挑選上述試驗(yàn)中濾紙酶活性較高的7個(gè)菌株進(jìn)行進(jìn)一步試驗(yàn)，將所獲得的菌株A25、A5、O7、0809、D2、H7、HD菌株接到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行搖床發(fā)酵培養(yǎng)后，在獲得發(fā)酵液的基礎(chǔ)上制得粗酶液。測定其濾紙酶活、CMC酶活和β-葡萄糖苷酶活。各菌株均設(shè)3個(gè)處理，取其平均值，如表3。

2.4 溫度對酶促反應(yīng)的影響 溫度對酶促反影響的原因主要有以下2個(gè)方面，一是溫度對酶蛋白穩(wěn)定性的影響，即對酶熱變性失活作用，二是溫度對酶促反應(yīng)本身的影響，其中可能包括影響酶和底物的結(jié)合，影響Vmax，影響酶和底物分子解離基團(tuán)的pK，影響酶與抑制劑、激活劑或輔酶的結(jié)合等[8]。吸粗酶液2mL和2mL DNS和1mL蒸餾水加入試管分別于40℃、50℃、60℃、70℃和80℃不同水浴鍋中處理30min后，對菌體的酶活進(jìn)行檢測，其結(jié)果見圖2。由圖2可見，反應(yīng)溫度對菌株A25的酶活有顯著影響，其最適酶活溫度為50℃，當(dāng)水浴處理溫度高于50℃或低于50℃時(shí)，該菌株A25酶活減弱，但是培養(yǎng)液仍具有較高的纖維素酶活力；同時(shí)也表明該菌株所產(chǎn)的纖維素酶具有較高熱穩(wěn)定性?？梢姡?0℃所測得的酶活力最高，即此酶的最適酶活溫度為50℃。

3 討論

3.1 高產(chǎn)纖維素酶菌株的初篩 纖維素在纖維素酶的作用下水解成纖維二糖和葡萄糖，水解后的糖類與剛果紅染料形成紅色沉淀，使產(chǎn)酶菌株的菌落周圍出現(xiàn)清晰的紅色水解圈，根據(jù)水解圈的大小可粗略的估計(jì)菌株產(chǎn)酶的情況，然后選取透明圈較大的菌株進(jìn)行接種。剛果紅是對纖維素酶進(jìn)行初步篩選的試驗(yàn)方法，實(shí)驗(yàn)方法比較簡單。通過它可以使纖維素固體培養(yǎng)基上的菌種的代謝產(chǎn)物形成淺紅色水解透明圈。用剛果紅染液覆蓋培養(yǎng)皿一層靜止染色30min，纖維素酶菌株產(chǎn)纖維素酶越多，產(chǎn)生的紅色水解透明圈越大，產(chǎn)纖維素酶速度越快，淺紅色水解透明圈出現(xiàn)的越早。雖然水解透明圈H/C的比值大小直接反映了酶活水平的高低，但不能完全代表菌株產(chǎn)酶能力，不能定量說明該菌株產(chǎn)纖維素酶的能力。也有研究表明液體樣品的酶濃度與透明圈的直徑（下轉(zhuǎn)127頁）（上接24頁）成線性關(guān)系，可以對酶活進(jìn)行初步定量[10]。

3.2 高產(chǎn)纖維素酶菌株的復(fù)篩 已知纖維素酶的作用方式：CO酶是使天然纖維素晶體分鏈，起一個(gè)分離和水合作用，從而使天然纖維素裂解成為直鏈纖維素；而C0酶雖不能水解天然纖維素，但能水解直鏈纖維素的β-l，4-葡萄糖苷鍵生成纖維二糖，纖維二糖再經(jīng)β-葡萄糖苷酶水解成為葡萄糖。前人研究認(rèn)為，纖維素的降解關(guān)鍵是濾紙酶活的高低，再結(jié)合β-葡萄糖苷酶活，而CMC酶活只作參考。通過對7個(gè)菌株發(fā)酵液的濾紙酶活、CMC酶活、β-葡萄糖苷酶活進(jìn)行測定，初步篩選出產(chǎn)纖維素酶活力較高的A25菌株。初步試驗(yàn)表明，在50℃反應(yīng)時(shí)間30min，pH5.5時(shí)A25菌株產(chǎn)生的纖維素酶的活性有較大提高。建議對A25進(jìn)行進(jìn)一步的優(yōu)化試驗(yàn)，以探明其最適的產(chǎn)酶條件，或?qū)ζ溥M(jìn)行進(jìn)一步的誘變，以提高其酶活性應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐。

3.3 溫度對纖維素酶活性的影響 從粗酶液中吸粗酶液2mL和2mL DNS和1mL蒸餾水加入試管中，在不同的水浴溫度下水浴處理30min后，對菌體的產(chǎn)酶量進(jìn)行檢測。為了確定酶活的最適溫度，通過測40～80℃不同溫度下的實(shí)驗(yàn)確定酶活，不同培養(yǎng)溫度對纖維素酶有不同的影響，結(jié)果表明，曲霉A25水浴處理在40℃時(shí)酶活力表現(xiàn)較低，50℃時(shí)酶活力達(dá)到最大值，水浴處理溫度超出50℃時(shí)酶活力逐漸變小。對于纖維素酶活的最適溫度為50℃，即纖維素酶產(chǎn)量的最適溫度在50℃。

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纖維素酶范文第4篇

【關(guān)鍵詞】 纖維素酶；生物學(xué)研究；生物學(xué)應(yīng)用進(jìn)展

doi：10.3969/j.issn.1004—7484（x）.2012.10.659 文章編號：1004—7484（2012）—10—4174—02

纖維素酶由多種水解酶組成，既能在大自然中合成，也是我國四大工業(yè)酶種工業(yè)合成的重要組成部分，它是一種可再生的、可持續(xù)發(fā)展的酶，它的主要作用就是催化纖維素轉(zhuǎn)化成葡萄糖，纖維素酶普遍存在于大自然中，很多真菌能夠分泌，纖維素酶多年來也廣泛的應(yīng)用于我國的食品工業(yè)、制酒工業(yè)以及紡織工業(yè)中，對我國發(fā)展具有極大的促進(jìn)作用。近年來，隨著生物工程的發(fā)展，對于纖維素酶分離純化、克隆以及其結(jié)構(gòu)的研究已經(jīng)成為人們研究的熱點(diǎn)以及要解決的難點(diǎn)問題。本文主要分析了纖維素酶組分、基因結(jié)構(gòu)、克隆及表達(dá)、作用機(jī)理、纖維素酶生活中應(yīng)用以及進(jìn)展研究。

1 纖維素酶組分

竇全林1等對于不同真菌產(chǎn)生的纖維素酶性質(zhì)以及種類做了研究，狹義上一般分成纖維二糖水解酶、內(nèi)切葡聚糖酶以及β葡糖苷酶，內(nèi)切葡聚糖酶是最初破壞纖維素鏈并且起作用的酶，纖維二糖水解酶經(jīng)內(nèi)切葡聚糖酶激活之后的酶，β葡糖苷酶可以分解纖維二糖，使之成為葡萄糖。通過三種酶的共同作用，能夠成功時(shí)的纖維素分解，變成葡萄糖，三者稱為完全纖維素酶系。

2 纖維素酶基因結(jié)構(gòu)

真菌編碼纖維素酶的基因主要在染色體上面，并且隨機(jī)分布，形成基因簇，各具備自己的轉(zhuǎn)錄以及調(diào)節(jié)相應(yīng)的單位，轉(zhuǎn)錄單位叫做轉(zhuǎn)錄終止子，但是目前纖維素酶基因結(jié)構(gòu)上的主要啟動因子還不是很明了，值得進(jìn)行進(jìn)一步研究。

3 纖維素酶克隆及表達(dá)

陳小堅(jiān)等對纖維素酶克隆及表達(dá)進(jìn)行了研究，纖維素酶克隆及表達(dá)主要包括獲得高產(chǎn)菌株以及基因、選擇宿主、構(gòu)建表達(dá)載體、進(jìn)行轉(zhuǎn)化等四大階段。首先是獲得高產(chǎn)菌株以及基因，對微生物進(jìn)行篩選，選出高產(chǎn)菌株，實(shí)施誘變措施進(jìn)行誘變，然后是獲得基因，如果已知基因序列的情況下，可以從基因組中調(diào)出，未知的情況下，可以從自然界中進(jìn)行微生物分離以及培養(yǎng)，選擇基因進(jìn)行克隆。其次，真菌是比較好的表達(dá)宿主，可以達(dá)到分泌蛋白量，進(jìn)行乙?；约疤腔@得纖維素酶的正確表達(dá)，獲得很高的蛋白產(chǎn)量。再者是構(gòu)建表達(dá)載體，對篩選方式、轉(zhuǎn)化以及表達(dá)的方式以及載體進(jìn)行構(gòu)建，爭取能夠啟動強(qiáng)啟動子，實(shí)現(xiàn)基因轉(zhuǎn)錄，提高啟動子效率，表達(dá)目標(biāo)蛋白，提高目標(biāo)蛋白產(chǎn)量。最后是進(jìn)行轉(zhuǎn)化，主要的轉(zhuǎn)化方式有氯化鋰、原生質(zhì)以及農(nóng)桿菌等轉(zhuǎn)化方式，有效提高轉(zhuǎn)化率。

4 纖維素酶作用機(jī)理

陳燕勤2等對纖維素酶作用機(jī)理進(jìn)行了探討，在1954年，GiIIigan等學(xué)者提出了纖維素酶能夠有效的促進(jìn)纖維素酶的分解的觀點(diǎn)，并且復(fù)合分解的效果大于單獨(dú)分解的效果。此后年間，更過的學(xué)者對于這種作用進(jìn)行了證明，證明方法包括電子顯微鏡以及多種菌種的纖維素酶的應(yīng)用。隨后，F(xiàn)aterstam等發(fā)現(xiàn)，纖維二糖水解酶的分解作用是一般的單組酶的兩倍之多，并且分解的時(shí)候，與內(nèi)切葡聚糖酶具有協(xié)同的作用，隨后更多的學(xué)者證明了這種理論，目前，專家以及學(xué)者們對于這種協(xié)同作用理論也大多呈認(rèn)可或者不反對狀態(tài)，具體還要做進(jìn)一步研究。

5 纖維素酶生活中應(yīng)用

李燕紅3等已經(jīng)對目前纖維素酶生活中應(yīng)用做了一個(gè)比較系統(tǒng)的研究，從1995到2005年，2005年工業(yè)上酶使用已經(jīng)為1995年的三倍，主要來源為美國以及日本，這兩個(gè)國家是纖維素酶應(yīng)用的兩大巨頭，目前纖維素酶以及被廣泛的應(yīng)用于我國的制酒、紡織、飼料以及食品業(yè)中，并且對于我國工業(yè)起到了極大的推動作用，首先在食品工業(yè)中，一方面，主要是進(jìn)行橄欖油以及果蔬汁的榨取，去除掉果汁以及蔬菜汁的沉淀物，促進(jìn)谷物水分吸收，去除豆子中的豆衣，實(shí)現(xiàn)谷物蛋白以及淀粉的成功分離等。另一方面，纖維素酶可以用于提取纖維寡糖等可溶性糖，脫離細(xì)胞壁，取出有用的蛋白等。

其次在制酒工業(yè)中，主要有力于葡萄酒以及啤酒的制造，利用纖維素酶，能夠促進(jìn)水解制酒過程中葡萄汁以及大麥汁，有效的分解沉淀物，提高過濾的效率，增加酒香，提高釀酒的效率，促進(jìn)釀酒業(yè)的發(fā)展。

再者是在紡織行業(yè)中，紡織行業(yè)纖維素酶的應(yīng)用仍然屬于比較新興的應(yīng)用，主要用于拋光以及打磨兩個(gè)階段，日常應(yīng)用范圍也比較廣，主要是能夠有效的取出衣物表面存在的碎纖維，方便家庭日常的洗滌工作，通過拋光以及打磨兩個(gè)階段，提高衣物光澤。

最后是飼料行業(yè)。這個(gè)行業(yè)我我國農(nóng)業(yè)的基礎(chǔ)，是保證滿足16億人口大國溫飽的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，而纖維素酶又是其中的重點(diǎn)問題，纖維素酶加入到飼料當(dāng)中，能夠起到很好的補(bǔ)充作用，增強(qiáng)動物體能，防止動物反芻事件發(fā)生。除此以外，還能通過應(yīng)用在纖維素物質(zhì)如去掉谷物殼等中，有效提高動物消化的效率，并且分泌相應(yīng)的物質(zhì)，促進(jìn)動物體內(nèi)的粗糙糧食得到消化以及吸收。

當(dāng)前，無論是能源問題還是食品問題都是建設(shè)中要解決的重點(diǎn)以及難點(diǎn)問題，纖維素酶作為一種生物工程主要建設(shè)工業(yè)酶，其成功的提取以及應(yīng)用，對于保證我國解決能源以及食品問題，促進(jìn)我國農(nóng)業(yè)發(fā)展有著空前意義，纖維素酶憑借其價(jià)格以及成本低廉、應(yīng)用廣泛、使用方便等特點(diǎn)，已經(jīng)成為人們關(guān)注的熱點(diǎn)話題之一，只有加強(qiáng)對纖維素酶組分、基因結(jié)構(gòu)、克隆及表達(dá)、作用機(jī)理、纖維素酶生活中應(yīng)用以及進(jìn)展進(jìn)行研究，才能使得各環(huán)節(jié)出現(xiàn)的問題得到很好的改善，促進(jìn)各個(gè)環(huán)節(jié)的完善，使得纖維素酶克隆及表達(dá)順利，實(shí)現(xiàn)成功的合成，并且利用纖維素酶，為我國的農(nóng)業(yè)、紡織業(yè)、制酒業(yè)以及飼料行業(yè)做出貢獻(xiàn)，隨著發(fā)展的深入，擴(kuò)展纖維素酶使用的范圍，促進(jìn)纖維素酶的發(fā)展，使其使用范圍深入到我們生活的各個(gè)方面，為我們生活做出貢獻(xiàn)。

參考文獻(xiàn)

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纖維素酶范文第5篇

關(guān)鍵詞：纖維素酶；膳食纖維；番茄；改性

中圖分類號：TS201.1文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A文章編號：1672-979X(2008)07-0032-03

Technology Study on Water-soluble Dietary Fiber Extracted by Cellulase

LIU Shao-peng, CHEN Wen, MU Chun-hai

(Key Laboratory of Xinjiang Phytomedicine Resources, Shihezi 832002, China)

Abstract：Objective To extract the water-soluble dietary fiber (SDF) from tomato insoluble dietary fiber (IDF) by cellulase. Methods The optimal technology was obtained by orthogonal test, then, the circulating extraction was arranged under the optimal condition. Results The optimum condition of SDF extraction was as follows: 10 % cellulose for 6 h at 55℃ with pH 4.0. Under the optimal condition, the circulating extraction was performed with a higher yield of 31.1%. Conclusion The optimal extraction technology can be obtained and the circulating extraction can be used to increase the extraction rate of SDF.

Key words：cellulase; dietary fiber; tomato; modification

近年膳食纖維（dietary fiber，DF）在人體健康中的作用引起了廣泛關(guān)注，被譽(yù)為“第七營養(yǎng)素”，其生理功能已經(jīng)研究證實(shí)[1-3]。膳食纖維分為可溶性膳食纖維（SDF）和水不溶性膳食纖維（IDF）。SDF能降低血脂含量、延緩小腸對葡萄糖的吸收速度，刺激胰島產(chǎn)生胰島素，從而預(yù)防糖尿病的發(fā)生[4]。但天然來源的膳食纖維中SDF含量很低。通過改性手段可以使一部分IDF溶解成為SDF，從而提高SDF產(chǎn)量。

在諸多膳食纖維改性方法中，以化學(xué)法、纖維素酶催化法和物理擠壓膨化增溶法常見。（1）物理擠壓膨化法改性在水中將膳食纖維升溫，膨化后強(qiáng)行使其通過某一固定孔徑，造成鍵斷裂，達(dá)到增加溶解度的目的。其產(chǎn)品顏色與提取所得的SDF接近，適合進(jìn)一步加工；（2）化學(xué)法改性加入強(qiáng)酸或強(qiáng)堿，在超過50 ℃的溫度下反應(yīng)，使部分纖維素糖苷鍵斷裂，增大溶解度。此法對環(huán)境影響很大，且制備的SDF顏色較深，不適合食品、藥品工業(yè)進(jìn)一步加工；（3）纖維素酶改性其原理與化學(xué)法相近，但產(chǎn)品顏色較淺，雜質(zhì)較少，造價(jià)低廉。本文主要討論纖維素酶法制取SDF的工藝，并進(jìn)一步優(yōu)化。

1材料和儀器

1.1試驗(yàn)材料

番茄纖維（新疆中基公司）；纖維素酶（北京奧博星公司）；95 %乙醇（上海振興化工一廠）。

1.2實(shí)驗(yàn)儀器

8002型水浴鍋；JB90-D型強(qiáng)力電動攪拌機(jī)；LXJ-II離心沉淀機(jī)；ZFA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；ZK-82A型真空干燥箱；SHZ-3型循環(huán)水真空泵。

2實(shí)驗(yàn)方法

2.1SDF含量測定

采用酶-重量法（AOAC法，即Association of Analytical Communities法）[5]。

2.2工藝實(shí)驗(yàn)

提取[6]：取5.00 g粗纖維，加250 mL水，置于60 ℃水浴30 min后，以3 500 r/min離心10 min，收集上清液，乙醇沉淀，濃縮，干燥得SDF，未溶解部分待用。

酶解：取提取后剩余的未溶解部分（即IDF）加200 mL水，加入一定量纖維素酶，于相應(yīng)pH、溫度、時(shí)間反應(yīng)后，3 500 r/min離心10 min，乙醇沉淀，離心，將所得沉淀于60 ℃干燥箱中干燥 2 h，即得SDF。稱重，計(jì)算產(chǎn)率，即為酶解后產(chǎn)量。

單因素考察酶使用量、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度和pH值4項(xiàng)因素（實(shí)驗(yàn)過程省略），根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果擬定3個(gè)水平，用L9（34）正交試驗(yàn)優(yōu)化工藝條件。

3結(jié)果與討論

3.1正交試驗(yàn)結(jié)果

見表2和表3。

由表2、表3可見，4項(xiàng)因素均無顯著差異，即4項(xiàng)因素所選水平都可作為工藝條件使用；各項(xiàng)因素對酶解產(chǎn)量的影響依次為酶解時(shí)間＞酶使用量＞酶解溫度＞pH。選擇第5組A2B2C3D1為最優(yōu)化條件。經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證，產(chǎn)量達(dá)到0.450 g，明顯優(yōu)于其他條件下的產(chǎn)量。

3.2酶法膳食纖維連續(xù)提取工藝的探討

由正交試驗(yàn)可知，上述工藝IDF改性制得SDF的產(chǎn)量不高。金毓荃等[7]用3步酶解法處理玉米皮膳食纖維得SDF。作者認(rèn)為，市售的纖維素酶為復(fù)合纖維素酶，主要由Ci、Cb和Cx組成，Ci和Cx是β-1,4葡糖酶，分別能外切和內(nèi)切β-1,4糖苷鍵，形成纖維寡糖；而Cb是纖維二糖酶，其作用是分解纖維素成為單糖，這個(gè)過程是不希望發(fā)生的。3步酶解法中由于Ci和Cx易吸附于底物上，在隨后的酶解過程中可以繼續(xù)發(fā)生作用；Cb則隨濾液大量分離，其不良作用大大降低，不僅提高了酶解產(chǎn)率，而且能保證最終產(chǎn)品的質(zhì)量。

本實(shí)驗(yàn)在此基礎(chǔ)上加以改進(jìn)，以循環(huán)套用、連續(xù)酶解的工藝提取SDF，設(shè)計(jì)了新的工藝路線，見圖1。

如圖1所示，第一次酶解后剩下的底物與新提取后產(chǎn)生的沉淀合并，經(jīng)過程Ⅱ處理后繼續(xù)反應(yīng)得SDF。每次工藝用5 g原料，提取工藝完畢后，將本次沉淀與上次反應(yīng)的沉淀混合，再加入等量的酶，于同一溫度、同一pH環(huán)境下反應(yīng)相同時(shí)間，連續(xù)反應(yīng)7次，結(jié)果見表4。

由表4可見，7次的酶解產(chǎn)量逐步提高，最終可達(dá)1.106 g。但反應(yīng)進(jìn)行7次之后（約43 h），容易染菌，導(dǎo)致產(chǎn)品質(zhì)量下降，故暫定工藝為7次循環(huán)。酶解效率=∑SDF酶解/（5×7）=0.122，即12.2 %（上述正交試驗(yàn)中酶解最高產(chǎn)率為8.8 %），證明該工藝確能提高SDF產(chǎn)率。

SDF產(chǎn)率=（∑SDF提取+∑SDF酶解）/（5×7）=31.1 %

通過檢驗(yàn)，產(chǎn)品純度可達(dá)91.3 %，完全可以作為食品添加劑或藥用輔料使用。

4結(jié)論

（1）本研究考察了番茄纖維IDF的不同酶解工藝，選定了合理的工藝路線。通過正交試驗(yàn)確立最佳酶解工藝條件為：酶使用量10 %，酶解時(shí)間6 h，酶解溫度60 ℃，pH 4.0；初步探討了循環(huán)套用即補(bǔ)料酶解方式連續(xù)提取SDF，使產(chǎn)率提高至31.1 %。酶解后產(chǎn)品為淡黃色粉末，易吸潮，易溶于水。

（2）在酶解纖維制取SDF產(chǎn)品時(shí)，循環(huán)工藝可以充分利用反應(yīng)底物和酶，在同等條件下提高產(chǎn)率。

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